Культивирование в естественных условиях-как мышиных астроциты, используя протокол быстрый, простой и недорогой AWESAM

Астроциты влияние функции мозга через трофические поддержки, поток крови, синаптических сигнализации и пластичности и межклеточные связи – все из которых являются механизмы, которые сосредоточены вокруг тонких Астроцитарная процессов. Протокол AWESAM, описанный здесь позволяет исследования этих процессов без помех от нейронов и другие глии, который является полезным например, потому что выражение многих белков и даже Ca^{2 +} сигнализации пересекаются через различные мозг клеток типы. Кроме того этот метод преодолевает ограничения ранее имеющихся методов. В частности, наш протокол обеспечивает в естественных условиях-как морфология (севрюга астроциты с тонкими процессов) и экспрессии генов в быстро, легко и дешевые манере.

Морфология клеток, экспрессии генов и многие другие нормативные процессы непосредственно зависят от окружающей среды. В культуре блюдо это относится к факторов, выпущенное окружающие клетки, но и среда, в которой выращиваются клетки. Для астроциты HBEGF сообщалось ранее побудить севрюга морфология¹ , но был также найден де дифференцировать астроциты². Однако, более низкие концентрации HBEGF впоследствии использовались для генерации более в естественных условиях-как астроциты, как определены через РНК последовательности в двух разных протоколов^3,4. Кроме того, экзоцитоз морфология изменяется с средний состав, независимо от протокола⁴: Neurobasal среды с низкой концентрацией HBEGF является оптимальным для выращивания севрюга астроциты, в то время как другие средние композиции (например, Сыворотка содержащих DMEM) производят полигональных клетки (даже в астроциты свежезаваренным изолированные immunopanning).

Протокол AWESAM преодолевает недостатки предыдущих методов для выращивания монокультур экзоцитоз⁴. Предыдущие методы для выращивания монокультур экзоцитоз имеют следующие недостатки: многоугольной морфологии, который несвойственной севрюга астроциты в vivo (MD метод)⁵; продолжительность и стоимость протокола (подготовка астроциты из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток занимает три месяца и требует много реагентов, включая дорогих факторы роста)⁶; низкое количество материала (метод immunopanning)³; и де дифференциация астроциты и требование 3D матрицы (Puschmann и др.) ^{1 , 2}. напротив, обеспечивает протокол AWESAM: в естественных условиях-как морфология (севрюга астроциты с тонкими процессов); быстрый, легкий и дешевый метод; большие количества материала; и в естественных условиях-как по сравнению с immunopanned и MD астроциты экспрессии генов. Кроме того, 2D культура позволяет для изучения Ca^{2 +} сигнализации и везикул, рециркуляции в тонкие процессы и в мероприятиях рядом мембраны (например, TIRF микроскопии возможен не в 3D культур).

MD метод широко использовался с момента его опубликования в 1980 году⁵, предлагая простой и быстрый метод для полигональных экзоцитоз монокультур. Короче говоря, метод MD влечет за собой рост клетки смешанных мозга в сыворотке крови плода теленка (FCS)-содержащих DMEM, следуют покачивая шаги, которые обогащают для астроциты (как все другие типы отсоединить от блюдо клеток головного мозга) и далее культуры в той же среде. DMEM дополнена FCS используется для многих других типов клеток, фибробластов и адипоцитов до рака различных клеточных линий, все из которых доля полигональных морфологии, проявляемой MD астроциты в культуре. До начала 2000-х⁷, мало мысли было уделено СМИ с учетом астроциты, конкретно в пользу их типичные севрюга морфологии найдено в естественных условиях. Один протокол, опубликованные в 2011 году достичь таких севрюга Морфология: вызывается метод immunopanning, он использует сыворотки свободный среднего, оптимизированный для культивирования астроциты³. С помощью этого метода, клетки мозга свежевыделенных подвергаются ряд блюд, покрытых антителами, которые целевой ячейки определенного типа клеток поверхности белки, чтобы обогатить астроциты. Несмотря на более в естественных условиях-как морфология и выражение профиль immunopanned астроциты, большинство в vitro исследования по-прежнему полагаются на методе экзоцитоз MD. MD метод является простым и быстрым, в то время как метод immunopanning включает в себя более сложным и длительным шаги в первый день культуры (например дольше Пищеварение энзима, тщательно наслаивать растворов различной плотности, immunopanning себя, и несколько центрифугирования шаги – все перед покрытием). Однако, используя более специализированных средних, метод AWESAM предлагает скорость метода MD и в естественных условиях-как морфология immunopanning протокола.

В целом, протокол AWESAM полезно для изучения более в естественных условиях-как астроциты в 2D монокультур, изолированных от нейронов и глии других (как ранее характеризуется⁴ , immunostainings, иммуноблотов и РНК последовательности). Это позволяет для изучения тонких Астроцитарная процессов и обеспечивает большую доступность для визуализации спонтанное Ca^{2 +} сигнализации и события близко к мембране (например, образы, TIRF микроскопия).