IκB киназы 1/α (IKK1/α CHUK) является Ser/Чет протеинкиназы, которая участвует в бесчисленных клеточной деятельности, главным образом через активацию NF-κB транскрипционных факторов. Здесь мы опишем основные шаги, необходимые для производства и определения структуры кристалла этого белка.
Класс внеклеточного раздражителей требует активации IKK1/α побудить поколения NF-κB Субблок p52, путем обработки его предшественник p100. P52 функции как Антуану или гетеродимера с другой NF-κB Субблок, RelB. Эти димеры в свою очередь регулируют выражение сотен генов, участвующих в воспаление, выживаемость клеток и клеточного цикла. IKK1/α главным образом остается связанной с IKK2/β и Немо как третичный комплекс. Однако небольшой бассейн это наблюдается также как низкой молекулярной массой complex(es). Неизвестно, если действие обработки p100 инициируется активации IKK1/α в течение большего или меньшего комплекс бассейна. Учредительный активность IKK1/α была обнаружена в нескольких раковых заболеваний и воспалительных заболеваний. Чтобы понять механизм активации IKK1/α и включить его использования в качестве целевого наркотиков, мы выразили рекомбинантных IKK1/α в различных хост-систем, таких как кишечная палочка, насекомых и млекопитающих клетки. Нам удалось выразить растворимых IKK1/α в бакуловирусы инфицированных насекомых клеток, получение количества мг чистого белка, кристаллизующийся в присутствии ингибиторов и определение его кристаллической структуры рентгеновского. Здесь мы описываем подробные шаги для получения рекомбинантных белков, его кристаллизации и его определения структуры рентгеновских кристалл.
Транскрипционный анализ деятельность в семейства NF-κB димерной транскрипционных факторов, необходимых для различных клеточных функций, начиная от воспаления и иммунитет для выживания и смерти. Эти мероприятия строго контролируются в клетки и потеря регулирование приводит к различных патологических состояний, включая аутоиммунных заболеваний и рака1,2,3. В отсутствие стимула деятельность NF-κB хранятся тормозится IκB (ингибитор – κB) белки4. Фосфорилирование конкретных Ser остатков на белки IκB помечает их ubiquitination и последующего протеосомной деградации или выборочной обработки5. Два весьма гомологичных Ser/Чет киназы, IKK2/β и IKK1/α, выступать в качестве центрального регуляторы деятельности NF-κB осуществляя эти события фосфорилирование6,7.
Взаимодействия лигандов и рецептор передает сигнал через ряд посредников, ведущие к активации NF-κB факторов. NF-κB сигнализации процесс широко можно подразделить на два различных пути – канонические и нестандартные (альтернативных)8. Деятельность IKK2/β главным образом регулирует NF-κB сигнализации канонический путь, который имеет важное значение для воспалительных и врожденный иммунный ответ9. Отличительная черта этого пути является быстрое и недолго активации10 IKK2/β в пределах до сих пор биохимически uncharacterized IKK комплекс — предположительно будет состоять из IKK1 и IKK2, а также нормативно-правовой компонент, Немо (NF-κB основные модулятор )11,12,13. Между двумя каталитического IKK подразделений комплекса IKK, IKK2 является главным образом ответственный14 для фосфорилирование конкретных остатков прототип IκBs (α, – β и – γ) обязан NF-κB, а также нетипичные IκB белок, NF-κB1/p105, который является предшественником NF-κB p50 Субблок5. Фосфорилирование индуцированной ubiquitination и деградации протеосомной IκB (или обработки p105) приводит к выпуска и активации определенного набора NF-κB димеры15. Аберрантное NF-κB активности из-за неправильного регулируемой функции IKK2 наблюдается во многих раках, также как и аутоиммунных расстройств2,3,16.
В отличие от IKK2/β активность IKK1/α регулирует NF-κB сигнализации нестандартные пути, который имеет важное значение для развития и иммунитет. IKK1 фосфорилирует конкретные остатки NF-κB2/p100 на ее сегмент C-терминала IκBδ, что приводит к ее обработка и генерация p52. Формирование транскрипционно активных p52:RelB гетеродимера инициирует медленно и устойчивого реагирования на развития сигналы7,,1718,19,20. Интересно, что поколения Центральной p52 фактора NF-κB этот путь зависит от другой фактор, NF-κB вызывая киназы (ник)21,22, но не на IKK2 или Немо. В клетках отдых уровень NIK остается низким из-за его постоянной протеасом зависимой деградации23,24,25. После стимуляции клеток «не канонических» лигандов и в некоторых злокачественных клеток Ник стабилизируется набирать и активировать IKK1 / α. киназы деятельности Ник и IKK1 имеют важное значение для эффективной обработки p100 в p527. IKK1 и Ник фосфорилировать трех serines (Ser866, 870 и 872) NF-κB2/p100 приводит к ее обработка и генерация p52 сегмента IκBδ C-терминала. Ошибочной активации нестандартные пути были причастны многих злокачественных опухолей, включая множественной миеломы26,27,28.
Известны несколько весьма эффективные и конкретные ингибиторы для IKK2/β, хотя никто до настоящего времени оказались быть эффективный препарат. В отличие от IKK1/α-специфические ингибиторы являются скудными. Это может частично обусловлены нашего отсутствия структурных и биохимических информации о IKK1/α, который ограничивает наше понимание механистический основы активацию NF-κB, IKK1 в клетки и рациональных наркотиков дизайн. Структуры рентгеновского IKK2/β предоставил нам взглянуть на механизм активации IKK2/β29; Однако, эти структуры не могут выявить как различных вышестоящих раздражителей вызвать срабатывание IKK1/α или IKK2/β регулировать различные наборы NF-κB деятельности 30,31. Чтобы понять механистический основания, лежащие в основе функции distinct сигнализации IKK1/α и создать платформу для рационального наркотиков дизайн, мы сосредоточены на определении структуры IKK1/α.
Производство, кристаллизации и структура решение двух родственных белков IKK
Мы задались целью определить рентгеновского Кристаллическая структура IKK1/α с понятием, что было бы относительно просто упражнения, учитывая наш опыт работы с IKK2/β производства белка, кристаллизации…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим сотрудников на излучение 19ID, 24ID и 13ID на расширенный источник фотон, Лемонт, Иллинойс, для поддержки во время сбора данных о различных кристаллов. Мы благодарны Lyumkis Дмитрий, Солка институт для выборки нас низким разрешением крио Эм карта на ранних стадиях Эм карта/построения модели, которая использовалась для построения начального IKK1 молекулярные замена Поиск модели. Исследований, приведших к эти результаты получил финансирование от НИЗ грантов, AI064326, CA141722 и GM071862 гг. SP в настоящее время Добро пожаловать доверять DBT Индии промежуточных парень.
Cellfectin/Cellfectin II | Thermo Fisher Scientific | 10362100 | Cellfectin is now discontinued, replaced by Cellfectin II |
Sf900 III Insect cell medium | Thermo Fisher Scientific | 12658-027 | |
SF9 cells | Thermo Fisher Scientific | 12659017 | |
anti-IKK1 antibody | Novus Biologicals | NB100-56704 | Previously sold by Imgenex |
anti-PentaHis antibody | Qiagen | 34460 | |
PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Nitrocellulose can also be used |
Ni-NTA agarose | Qiagen | 30210 | |
Bradford assay reagent | BioRad | 500001 | |
Superdex 200 column | GE Healthcare | 28989335 | |
Amicon concentrator | Millipore | UFC801008, UFC803008, UFC201024, UFC203024 | |
Compound A | Bayer | ||
Calbiochem IKK-inhibitor XII | Calbiochem | 401491 | |
Staurosporine | SIGMA | S4400 | |
MLN120B | Millenium | Gift item | |
AMPPNP | SIGMA | A2647 | |
Dextran sulfate | SIGMA | 51227, 42867, 31404, | |
Dextran sulfate | Alfa Aesar | J62101 | |
PEG | SIGMA | 93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172 | Some of them are new Cat # on SIGMA catalogue. What we had was originally from Fluka that had different Cat #. |
Crystallization Screens | |||
Crystal Screen I and II (Crystal Screen HT) | Hampton Research | HR2-130 | |
Index HT | Hampton Research | HR2-134 | |
PEG/Ion and PEG/Ion2 (PEG/Ion HT) | Hampton Research | HR2-139 | |
PEGRX 1 and PEGRx 2 (PEGRx HT) | Hampton Research | HR2-086 | |
SaltRx 1 and SaltRx 2 (SaltRx HT) | Hampton Research | HR2-136 | |
Crystal mounts | Hampton Research | HR8-188, 190, 192, 194 | |
Synchrotron | The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy’s Argonne National Laboratory | Beamline 19 ID | The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy’s Argonne National Laboratory provides ultra-bright, high-energy storage ring-generated X-ray beams for research in almost all scientific disciplines. |