Summary

질량 분석 기반 식별 RNA 바인딩 영역에 대 한 샘플 준비

Published: September 28, 2017
doi:

Summary

우리는 RNA 의무적인 단백질을 확인 하 고 중재 하는 UV photocrosslinking 및 질량 분석을 사용 하 여 라이브 셀에서 그들의 RNA 바인딩 영역 지도를 프로토콜을 설명 합니다.

Abstract

Noncoding RNAs 유전자 발현, chromatin 구조, 및 DNA 복구 통제 등 여러 가지 핵 프로세스에서 중요 한 역할을 재생 합니다. 대부분의 경우에서 noncoding RNAs의 행동은 누구의 기능 차례로 noncoding RNAs와의 이러한 상호 작용에 의해 통제 된다 단백질에 의해 중재 됩니다. 이 일치, 핵 기능에 관련 된 단백질의 증가 RNA를 바인딩할 보고 되었습니다 그리고 몇 가지 경우에이 단백질의 RNA 바인딩 영역 매핑 되었습니다, 자주 힘 드는, 후보 기반 방법을 통해.

여기, 우리는 RNA 의무적인 단백질 및 RNA 바인딩 영역 그들의 높은 처리량, 프로테옴 전체 편견된 식별을 수행 하기 위해 상세한 프로토콜을 보고 합니다. 방법론 photoreactive uridine 아날로그 세포질 RNA, UV 중재 단백질-RNA 가교 및 질량 분석 분석 공개는 프로테옴 내 RNA-가교 된 펩 티 드에서에서의 설립에 의존 합니다. 마우스 배아 줄기 세포에 대 한 절차를 설명 하 고, 비록 배양된 세포의 다양 한 프로토콜을 쉽게 적응 한다.

Introduction

RBR ID 방법의 목적은 새로운 RNA 의무적인 단백질 (RBPs)를 식별 하 여 펩 티 드 수준 해상도 RNA 바인딩 돌연변이의 디자인 및 생물학 및 생 화 확 적인 조사를 촉진 하기 위하여 그들의 RNA 바인딩 영역 (RBRs) 지도 단백질 RNA 상호 작용의 기능입니다.

RNA는 생체 중 고유 수 모두 유전 정보를 운반 하는 메신저 역할을 하 고도 생화학 기능 단백질1,2의 유사 더 많은 복잡 한 3 차원 구조에 접어. 증거의 성장 시체 noncoding RNAs (ncRNAs) 다양 한 유전자 규정 하는 후 성적인 경로3,,45 에 중요 한 역할을, 일반적으로, 이러한 규정 하는 기능 콘서트 중재는 제안 특히 주어진된 RNA와 상호 작용 하는 단백질 특정 한 관련성의 상호 작용 단백질의 집합 최근 심각 하 게 공부 긴 ncRNA (lncRNA) Xist,이 lncRNA 여성 셀6,7 x 염색체 비활성화를 중재 하는 방법에 대 한 값진 통찰력을 제공에 대 한 확인 되었다 ,8. 특히, 이러한 Xist 상호 작용 단백질의 몇 없는 어떤 정식 RNA 바인딩 도메인9, 그리고 그러므로 그들의 RNA 바인딩 작업 수 없습니다 예측 철에서 혼자 그들의 기본 시퀀스에 따라. LncRNAs의 수천 어떤 주어진된 셀10표현 됩니다 고려, 아직 될 RNA 의무적인 단백질 (RBPs) 발견 그들 중 많은와 상호 작용을 통해 행동 수도 있습니다 가정 하는 합리적입니다. 이러한 소설 RBPs 식별 하는 실험적인 전략 것입니다 따라서 크게 용이 하 게 ncRNAs의 생물 학적 기능 해 부의 작업.

RBPs 경험적으로 식별 하는 이전 시도 polyA + RNA 선택 질량 분석 (MS)11,12,13,,1415에 결합에 의존 했습니다. 비록이 실험 상 상속 RBPs의 목록에 많은 단백질을 추가, 디자인에 의해 그들은 감지할 수 단백질 polyadenylated 성적표에 바인딩된. 그러나, 대부분의 작은 RNAs 및 많은 lncRNAs polyadenylated 되지 않습니다. 16 , 17 그리고 그들의 상호 작용 단백질 것 가능성이 되었습니다 놓친이 실험에서. 최근 연구 공동 여러 알려진된 RBPs와 정화 하 고 이러한 재발 RBP 파트너 RNA 바인딩 활동18보유 가능성이 것으로 나타났다 단백질을 식별 하기 위해 단백질-단백질 위하여 데이터베이스에 기계 학습을 적용. 그러나,이 방법은 기존의 큰 상호 작용 데이터베이스 마이닝에 의존 하며만 공동 알려진된 RBPs, 따라서 불용 성, 막 임베디드 및 부족 한 분석에서 제외 된 비 변성 시키기 조건에 순화 될 수 있는 단백질을 확인할 수 있습니다. 단백질입니다.

Id는 단백질의 한 진실 fide RBP로 종종 단백질 RNA 상호 작용의 생물학 및 생 화 확 적인 기능에 대 한 정보를 자동으로 생성 하지 않습니다. 해결 하기 위해이 시점, 그것은 일반적으로 특정 돌연변이 각 소설 RBP19, 의 맥락에서 RNA 바인딩 기능을 테스트 하도록 설계 된 수 수 있도록 단백질 도메인 및 아미노산 잔류물 상호 작용에 관련 된 식별 하는 것이 좋습니다. 20. 우리의 그룹 및 다른 사람에 의해 이전 노력 사용 재조합 형 단백질 파편 삭제 돌연변이 RNA 바인딩 영역 (RBRs)19,20,,2122;을 식별 하 그러나, 이러한 접근은 노동 집약 및 높은 처리량 분석와 호환 되지 않는. 더 많은 최근 연구 질량 분석23;를 사용 하 여 높은 처리량 패션에서 RNA 바인딩 활동을 지도 하는 실험적인 전략 설명 그러나,이 방법은 이중 polyA + RNA 선택에 의존 하 고 따라서 위에서 설명한 RBP 식별 방식으로 동일한 제한 실시.

우리 나 RNA 바인딩 영역 id RBR-, photocrosslinking 단백질-RNA와 단백질 및 단백질 영역 만들기 없이 라이브 세포에서 RNA 상호 작용을 식별 하기 위해 양적 질량 분석을 이용 하는 기술 개발 RNA polyadenylation 상태에 가정, polyA RNAs24에 바인딩된 따라서 RBPs를 포함 한. 또한,이 방법은 가교를 독점적으로 의존 단백질 가용성 또는 액세스 가능성 요구 사항은 없습니다 고 따라서 내 막 (예: 핵 봉투) 또는 가난 하 게 녹는 구획 (RNA 바인딩 활동 지도에 적합 예를 들어 핵 매트릭스)입니다. 마우스 배아 줄기 세포 (mESCs)의 핵에 대 한 RBR-ID를 수행 하는 실험 단계 설명 하지만 사소한 수정이 프로토콜 적합 해야한다 다양 한 세포 유형, 그들은 효율적으로 문화에서 4SU를 통합할 수 있는 중간입니다.

Protocol

1. 문화 및 mESCs의 확장 참고: 마우스 배아 줄기 세포 문화에 쉽게 하 고 그들의 빠른 사이클 시간 덕분에 생 화 확 적인 실험에 필요한 큰 숫자를 신속 하 게 확장 될 수 있다. 건강 한 mESCs 더블 모든 12 헤 MESC gelatinized 번호판에 원하는 번호를 확장 mESCs 매체 (아래 참조) 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° c, 5% CO 2, 보관 및 > 95% 습도. 참고: 3-5에 대 한 생물 ?…

Representative Results

그림 1 RBR ID 워크플로를 보여 줍니다. 때문에이 기술은 상대적으로 낮은 가교 효율 생물 복제 걸쳐 고갈 수준 및 관찰 된 효과 (P-값)의 일관성을 고려 하는 매우 중요 하다. 그림 2 는 RBR ID 결과의 화산 줄거리. 펩 티 드 RNA 승인 주제 (RRM) 도메인을 겹쳐 높게 일관 된 고갈 수준 표시. RRM 도메인 RBR ID 분석에 대 한 긍정적인 ?…

Discussion

자세한 실험 프로토콜 RBR-ID를 mESCs로 하 고, RNA 4SU를 통합할 수 있는 모든 셀에 적절 한 수정 수행을 설명 합니다. 다른 세포 유형 충분 한 신호 대 잡음 비를 되도록 접근 방법의 최적화가 필요할 수 있습니다. 또한, 프로토콜 설명 여기 핵 RBPs 시험에 초점을 맞추고, 하는 동안 RBR-ID 기술 한다 쉽게 적용할 cytosol 또는 특정 세포와 같은 다른 세포질 구획 다른 분류를 사용 하 여 전략입니다. 최적화 ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

R.B.는 Searle 학자 프로그램, 트 면 스미스 재단 (C1404), 그리고 천 재단 (1-년도-15-344)의 3 월에 의해 지원 되었다. B.A.G는 NIH에서 지원 R01GM110174 및 NIH R01AI118891 국방부 뿐만 아니라 BC123187P1를 부여 부여 인정 합니다. R.W.-T. NIH 훈련 그랜트 T32GM008216에 의해 지원 되었다.

Materials

KnockOut DMEM Fisher Scientific 10829018
Fetal bovine serum, qualified, US origin Fisher Scientific 26140079
L-Glutamine solution 200 mM Sigma G7513
Penicillin-Streptomycin solution Sigma P0781
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×) Sigma M7145
2-Mercaptoethanol Sigma M3148
ESGRO Leukemia Inhibitory Factor (LIF) EMD Millipore ESG1106
CHIR99021 Tocris 4423
PD0325901 Sigma PZ0162
Gelatin solution,2% in water Sigma G1393
4-thiouridine Sigma T4509 50 mM stock in water
Spectrolinker XL-1500 Fisher Scientific 11-992-90
Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma 78830
IGEPAL CO-630 Sigma 542334 Commercial form of octyl-phenoxy-polyethoxy-ethanol detergent
Iodoacetamide Sigma I6125
Trypsin, sequencing grade Promega V5111
Empore solid phase extraction disk 3M 66883
OLIGO R3 Reversed – Phase Resin Fisher Scientific 1133903
Benzonase Sigma E8263 High purity nuclease
Sonic Dismembrator Model 100 Fisher Scientific discontinued updated with FB505110
HPLC grade acetonitrile Fisher Chemical A955-4
HPLC grade water Fisher Scientific W6 4
TFA Fisher Scientific A11650
Ammonium Bicarbonate Sigma A6141
Acetic Acid Sigma 49199
Formic Acid Sigma F0507
ReproSil-Pur 18-AQ Dr. Maisch GmbH HPLC r13.aq.0003 Packing material for HPLC column
Capillary for nano columns (75 µm) Molex 1068150017
MaxQuant software Max Planck Institute for Biochemistry Can perform chromatographic alignment of multiple MS runs

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Warneford-Thomson, R., He, C., Sidoli, S., Garcia, B. A., Bonasio, R. Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions. J. Vis. Exp. (127), e56004, doi:10.3791/56004 (2017).

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