Isolering av humane myoblaster, vurdering av myogen differensiering og oppbevaringsoperert kalsiummåling

Menneskeskelettmuskulaturen består av grupper av kontraktile multinukleerte muskelfibre som er resultatet av fusjon av myogene forløperceller. Skelettmuskler har evne til å regenerere etter skade takket være forekomsten av SC, skjelettmuskelstamceller som ligger mellom plasmamembranen av myofibere (sarcolemma) og basallamina. I ubeskadigede muskler er SCs for det meste tilstede i en sovende tilstand. Som respons på mekanisk stress eller skade blir SCs aktivert (myoblaster), proliferere og undergå enten differensiering for å danne nye myofibere eller selvfornyelse for å fylle opp SC-bassenget ^{1 , 2} . Gjennom årene ble flere teknikker utviklet for å isolere SC og deres avkom, myoblaster, fra skjelettmuskelbiopsier. Med større forståelse av celleoverflate markørene uttrykt på disse cellene og metoden for fluorescensaktivert cellesortering (FACS) ^{3, 4 , 5} , er det nå mulig å isolere rene populasjoner av humane myoblaster fra muskelprøver.

Kalsiumsignaler regulerer skjelettmuskelutvikling, homeostase og regenerering. Spesielt er Ca ²⁺ -inngangen som aktiveres etter intracellulær butikkutslipp, kalt SOCE, av stor betydning ⁶ for disse prosessene. Ved cellestimulering reduseres Ca ²⁺ -nivået i endo / sarcoplasmisk retikulum (ER / SR), som igjen aktiverer plasmamembran Ca ²⁺ -kanaler som tillater Ca ²⁺ -oppføring å fylle ER / SR ^{7 igjen} . De to hovedproteinene som er involvert i SOCE er ER / SR Ca ²⁺ -sensingstromal-interaksjonsmolekylet 1 (STIM1) -proteinet og plasmamembranen Ca ²⁺ -kanalen Orai1. Skjelettmuskulatur uttrykker i stor grad disse to proteinene, så vel som andre proteiner av samme familie (STIM2 aNd Orai2-Orai3) ^{8 , 9} og flere Ca ²⁺ -permeable kanaler i den transiente reseptorpotensialkanoniske familien (TRPC) ^{10 , 11 , 12 , 13} . Ca ²⁺ oppføring gjennom SOCE-banen er av stor betydning for muskeldannelse / regenerering ¹⁴ . Mutasjoner av STIM1- eller Orai1-proteiner har skadelige virkninger på muskelfunksjon, som hovedsakelig fører til muskelhypotoni ¹⁵ . Dyremodeller med SOCE-svekkelse viser også redusert muskelmasse og kraft, sammen med forbedret tretthet ^{6 , 16 , 17} . Som nevnt uttrykkes andre STIM- og Orai-proteiner, så vel som mange TRPC-kanaler, i skjelettmuskulaturen, og deres respektive roller har ikke blitt bestemt til nå. Ved å banke på dEier deres uttrykksnivå, er det således mulig å undersøke deres implikasjoner i SOCE og deres roller under human skjelettmuskulær differensiering.

SOCE måling kan utføres ved hjelp av to forskjellige tilnærminger: elektrofysiologiske nåværende opptak og Ca ²⁺ målinger. Elektrofysiologi er absolutt en mer direkte metode, da den måler gjeldende interesse og tilhørende elektrofysiologisk signatur. Denne teknikken er imidlertid svært vanskelig å bruke på muskelceller, hovedsakelig på grunn av muskelcellens store størrelse og den lille størrelsen på den endogene SOCE-strømmen. Cytosolisk Ca ²⁺ avbildning er teknisk svært tilgjengelig, men målet er mer indirekte, da Ca ²⁺ -nivået målt i cytosolen reflekterer både opptaket av Ca ²⁺ og repumping ut av cellen eller i de interne butikkene.

En metode som inkluderer isolering av myoblaster fra små biter av menneskeskallEtalmuskel etter enzymatisk fordøyelse, amplifikasjon og FACS er forklart i dette papiret. Prosessen med muskeldifferensiering og immunfluorescensprotokollen for å følge uttrykket av differensieringsmarkører over tid er beskrevet ¹⁸ . Til slutt forklares målingen av SOCE og rollen av forskjellige ionkanaler i Ca ²⁺ signalering og skjelettmuskeldifferensiering.