בידוד של Myoblasts האדם, הערכה של בידול Myogenic, ו-מופעלות סידן מופעל מדידה
Summary
כאן, אנו מתארים מתודולוגיה כדי להשיג אוכלוסייה טהורה של myoblasts האדם מן רקמת שריר בוגר. תאים אלה משמשים ללמוד בידול שריר השלד במבחנה , בפרט, ללמוד חלבונים המעורבים Ca 2 + איתות.
Abstract
תאי הלוויין (SC) הם תאי גזע שרירים הממוקמים בין קרום הפלזמה של סיבי השריר לבין הלמינה הבסיסית. הם חיוניים עבור התחדשות שריר. עם פגיעה, אשר מתרחשת לעתים קרובות בשרירי השלד, SCs מופעלים. הם מתרבים כמו myoblasts ולהבדיל לתקן נגעים שרירים. בין אירועים רבים המתרחשים במהלך בידול השריר, cytosolic Ca 2 + אותות הם בעלי חשיבות רבה. אלה Ca 2 + אותות נובעים Ca 2 + שחרור מ הפנימי Ca 2 + חנויות, כמו גם מ Ca 2 + כניסה מהחלל תאיים, במיוחד את החנות המופעלות Ca 2 + כניסה (SOCE). מאמר זה מתאר מתודולוגיה המשמשת כדי להשיג אוכלוסייה טהורה של myoblasts האדם מדגימות שריר שנאספו לאחר ניתוח אורתופדי. הרקמה היא מתעכל מכנית אנזימטית, ואת התאים הם מוגבר ולאחר מכן מיון על ידי cytometry הזרימה על פי נוכחות של speciסמני קרום. לאחר שהושג, myoblasts האדם מורחבים ומחויבים להבדיל על ידי הסרת גורמי גדילה מן המדיום התרבות. רמות הביטוי של גורמים שעתוק ספציפיים ב immunosluorescence חוץ גופית משמשים כדי להעריך את תהליך בידול myogenic בתנאי שליטה לאחר השתקת חלבונים המעורבים Ca 2 + איתות. לבסוף, אנו מפרטים את השימוש Fura-2 כמו ratiometric Ca 2 + בדיקה המספק מדידות אמין לשחזור של SOCE.
Introduction
שרירי השלד האנושיים מורכבים מקבוצות של סיבי שריר רב-תכליתיים, סינתטיים, הנובעים מאיחוי של תאים מבשר מיוגניים. שרירי השלד יש את היכולת להתחדש לאחר הפציעה תודה לנוכחות של SCS, תאי גזע שריר השלד הממוקם בין קרום הפלזמה של myofibers (sarcolemma) ואת הלמידה הבסיסית. בשרירים ללא פגע, SC הם בעיקר נוכחים במצב שקט. בתגובה ללחץ מכני או לפציעה, SC הופכים לפעילים (myoblasts), מתרבים, ועוברים תהליך הבחנה כדי ליצור מיופיבים חדשים או חידוש עצמי כדי לחדש את מאגר ה- SC 1 , 2 . במהלך השנים, מספר טכניקות פותחו כדי לבודד SCs הצאצאים שלהם, myoblasts, מן ביופסיות שריר השלד. עם הבנה גדולה יותר של פני השטח סמנים תאים הביע על תאים אלה ואת המתודולוגיה של מינון תא מופעלת הקרינה (FACS) 3, 4 , 5 , עכשיו ניתן לבודד אוכלוסיות טהור של myoblasts האדם מדגימות שרירים.
סידן איתות מסדיר את התפתחות שריר השלד, הומיאוסטזיס, התחדשות. בפרט, הכניסה Ca 2 + המופעל בעקבות דלדול החנות תאיים, הנקראים SOCE, הוא בעל חשיבות רבה 6 עבור תהליכים אלה. לאחר גירוי התא, רמת Ca 2 + ב reticulum endo / sarcoplasmic (ER / SR) פוחתת, אשר בתורו מפעילה ממברנה פלזמה Ca 2 + ערוצים המאפשרים Ca 2 + כניסה למלא את ER / SR 7 . שני חלבונים עיקריים המעורבים SOCE הם ER / SR Ca 2 + -חישה מולקולת אינטראקציה סטרומה 1 (STIM1) חלבון הממברנה פלזמה Ca 2 + ערוץ Orai1. שריר השלד מבטא בשפע את שני החלבונים הללו, כמו גם חלבונים אחרים של אותן משפחות (STIM2Ora Orai2-Orai3) 8 , 9 ו כמה קה 2 + ערוצי לערוץ של קולטן חולף פוטנציאלי (TRPC) משפחה 10 , 11 , 12 , 13 . Ca 2 + כניסה דרך מסלול SOCE הוא בעל חשיבות רבה עבור היווצרות שריר / התחדשות 14 . מוטציות של חלבונים STIM1 או Orai1 יש השפעות מזיקות על תפקוד השרירים, המוביל בעיקר לשריר היפוטוניה 15 . מודלים בעלי חיים עם ליקוי SOCE גם להציג מסת שרירים מופחת כוח, יחד עם עייפות משופרת 6 , 16 , 17 . כאמור, חלבונים אחרים של STIM ו- Orai, כמו גם ערוצי TRPC רבים, מתבטאים בשרירי השלד, ותפקידים אלה לא נקבעו עד כה. על ידי דפיקות דמשלו רמת הביטוי שלהם, ולכן ניתן לחקור את ההשלכות שלהם ב- SOCE ואת תפקידיהם במהלך בידול שריר השלד האנושי.
המדידה SOCE ניתן לבצע באמצעות שתי גישות שונות: הקלטות הנוכחי אלקטרו ו Ca 2 + מדידות. Electrophysiology הוא בהחלט שיטה ישירה יותר, כפי שהיא מודדת את הנוכחי של עניין וחתימה אלקטרופיזיולוגי הקשורים אליו. עם זאת, טכניקה זו קשה מאוד להחיל על תאי השריר, בעיקר בגלל גודל גדול של תאי שריר וגודל קטן של הנוכחי SOCE אנדוגני. Cytosolic Ca 2 + הדמיה היא טכנית מאוד נגיש, אבל המדד הוא יותר עקיף, כמו Ca 2 + רמת נמדדת cytosol משקף הן את כניסת Ca 2 + ואת שאיבה מחדש מתוך התא או בחנויות הפנימיות.
מתודולוגיה הכוללת בידוד myoblasts מ חתיכות קטנות של skel האדםשריר etal לאחר עיכול אנזימטי, הגברה, FACS מוסבר במאמר זה. תהליך של בידול שרירים ואת פרוטוקול immunofluorescence לעקוב אחר הביטוי של סמנים בידול לאורך זמן מתוארים 18 . לבסוף, המדידה של SOCE ואת התפקיד של ערוצי יון שונים Ca 2 + איתות והבחנה שריר השלד מוסברים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הבידוד והתרבות של myoblasts האדם מן שריר השלד המבוגר מציע מודל במבחנה ללמוד בידול שרירים התחדשות שרירים. במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקול המאפשר טיהור של תשואות גבוהות של myoblasts האדם בצורה פשוטה וחסכונית. בנוסף, טכניקה זו מספקת תוצאות אמין לשחזור במונח?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי קרן המדע הלאומית השוויצרית (מענק מס '310030-166313), "The Fondation Suisse pour la recherche sur les maladies musculaires", "Foundation Marcel Levaillant" ו- "Fondation pour la recherche ostéo-articulaire".
Materials
| Ham’s F10 | ThermoFisher Scientific | 31550-023 | |
| FCS | ThermoFisher Scientific | 10270-106 | Lot 41G5532K |
| BSA | Sigma | O5482 | |
| fetuin | Sigma | F3385 | |
| EGF | Corning | 354001 | |
| Dexamethansone | Sigma | D1756 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Creatine | Sigma | 27900 | |
| Pyruvate | Sigma | P4562 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15710-049 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | ThermoFisher Scientific | 25300-062 | |
| 70 μm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| 40 μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Falcon 50 ml tube | Falcon | 352070 | |
| Falcon 15 ml tube | Falcon | 352096 | |
| Falcon 5 ml tube (FACS) | Falcon | 352058 | |
| Culture medium: OPTI-MEM | ThermoFisher Scientific | 31985-047 | |
| Transfectant reagnt: RNAiMax | ThermoFisher Scientific | 1756064 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 14190-094 | |
| Mounting medium | Fluka | 10981 | |
| Mouse anti-MyHC * | DSHB | MF20 | concentrate |
| Mouse anti-myogenin | BD Pharmigen | 556358 | |
| Rabbit anti-MEF2 | Santa Cruz Biotech | C-21 | |
| Goat anti-mouse Alexa488 | ThermoFisher Scientific | A11029 | |
| Goat anti-rabbit Alexa 546 | ThermoFisher Scientific | A11035 | |
| Mouse anti human CD56-Alexa488 | BD Pharmingen | 557699 | |
| Mouse anti human CD146-PECy7 | BD Pharmingen | 562135 | |
| Mouse anti human CD45-PE-CF594 | BD Pharmingen | 562279 | |
| Mouse anti human CD34-APC | BD Pharmingen | 345804 | |
| Mouse anti human CD144-PE | BD Pharmingen | 560410 | |
| Alexa Fluor 488 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 557702 | |
| PECy7 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 557872 | |
| PE-CF594 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 562292 | |
| APC mouse IgG1k | BD Pharmingen | 550854 | |
| PE mouse IgG1k | BD Pharmingen | 556650 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | CAUTION: toxic compound |
| Paraformaldehyde | Fluka | 762400 | |
| Fura-2 AM | ThermoFisher Scientific | F1201 | |
| Pluronic F-127 | ThermoFisher Scientific | P3000MP | |
| Thapsigargin | Sigma | T9033 | CAUTION : toxic compound |
| Ratio imaging acquisition software: Metafluor 6.3 | Molecular Device | ||
| * : MF 20 was deposited to the DSHB by Fischman, D.A. | |||
References
- Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. Satellite Cells and Skeletal Muscle Regeneration. Compr Physiol. 5 (3), 1027-1059 (2015).
- Sambasivan, R., Tajbakhsh, S. Adult skeletal muscle stem cells. Results Probl Cell Differ. 56, 191-213 (2015).
- Chen, W. C., et al. Isolation of blood-vessel-derived multipotent precursors from human skeletal muscle. J Vis Exp. (90), e51195 (2014).
- Zheng, B., et al. Isolation of myogenic stem cells from cultures of cryopreserved human skeletal muscle. Cell Transplant. 21 (6), 1087-1093 (2012).
- Charville, G. W., et al. Ex Vivo Expansion and In Vivo Self-Renewal of Human Muscle Stem Cells. Stem Cell Reports. 5 (4), 621-632 (2015).
- Stiber, J., et al. STIM1 signalling controls store-operated calcium entry required for development and contractile function in skeletal muscle. Nat Cell Biol. 10 (6), 688-697 (2008).
- Prakriya, M., Lewis, R. S. Store-Operated Calcium Channels. Physiol Rev. 95 (4), 1383-1436 (2015).
- Darbellay, B., et al. STIM1- and Orai1-dependent store-operated calcium entry regulates human myoblast differentiation. J Biol Chem. 284 (8), 5370-5380 (2009).
- Darbellay, B., et al. Human muscle economy myoblast differentiation and excitation-contraction coupling use the same molecular partners, STIM1 and STIM2. J Biol Chem. 285 (29), 22437-22447 (2010).
- Nilius, B., Owsianik, G., Voets, T., Peters, J. A. Transient receptor potential cation channels in disease. Physiol Rev. 87 (1), 165-217 (2007).
- Vandebrouck, C., Martin, D., Colson-Van Schoor, M., Debaix, H., Gailly, P. Involvement of TRPC in the abnormal calcium influx observed in dystrophic (mdx) mouse skeletal muscle fibers. J Cell Bio. 158 (6), 1089-1096 (2002).
- Antigny, F., Koenig, S., Bernheim, L., Frieden, M. During post-natal human myogenesis, normal myotube size requires TRPC1- and TRPC4-mediated Ca(2)(+) entry. J Cell Sci. 126 (11), 2525-2533 (2013).
- Brinkmeier, H. TRP channels in skeletal muscle: gene expression, function and implications for disease. Adv Exp Med Biol. 704, 749-758 (2011).
- Pan, Z., Brotto, M., Ma, J. Store-operated Ca2+ entry in muscle physiology and diseases. BMB Rep. 47 (2), 69-79 (2014).
- Lacruz, R. S., Feske, S. Diseases caused by mutations in ORAI1 and STIM1. Ann N Y Acad Sci. 1356, 45-79 (2015).
- Li, T., et al. STIM1-Ca(2+) signaling is required for the hypertrophic growth of skeletal muscle in mice. Mol Cell Biol. 32 (15), 3009-3017 (2012).
- Wei-Lapierre, L., Carrell, E. M., Boncompagni, S., Protasi, F., Dirksen, R. T. Orai1-dependent calcium entry promotes skeletal muscle growth and limits fatigue. Nat Commun. 4, 2805 (2013).
- Konig, S., et al. Membrane hyperpolarization triggers myogenin and myocyte enhancer factor-2 expression during human myoblast differentiation. J Biol Chem. 279 (27), 28187-28196 (2004).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
- Bigot, A., et al. Age-Associated Methylation Suppresses SPRY1, Leading to a Failure of Re-quiescence and Loss of the Reserve Stem Cell Pool in Elderly Muscle. Cell Rep. 13 (6), 1172-1182 (2015).
- Bettadapur, A., et al. Prolonged Culture of Aligned Skeletal Myotubes on Micromolded Gelatin Hydrogels. Sci Rep. 6, 28855 (2016).
- Darbellay, B., Arnaudeau, S., Bader, C. R., Konig, S., Bernheim, L. STIM1L is a new actin-binding splice variant involved in fast repetitive Ca2+ release. J Cell Biol. 194 (2), 335-346 (2011).
- Sauc, S., et al. STIM1L traps and gates Orai1 channels without remodeling the cortical ER. J Cell Sci. 128 (8), 1568-1579 (2015).
- Demaurex, N. Calcium measurements in organelles with Ca2+-sensitive fluorescent proteins. Cell Calcium. 38 (3-4), 213-222 (2005).
