Isolamento de mioblastos humanos, avaliação da diferenciação miogênica e medição de entrada de cálcio armazenada

Os músculos esqueletais humanos são compostos de grupos de fibras musculares contrácteis e multinucleadas resultantes da fusão de células precursoras miogênicas. Os músculos esqueléticos têm a capacidade de regenerar após lesão graças à presença de SCs, as células estaminais do músculo esquelético localizadas entre a membrana plasmática das miofibras (sarcolemma) e a lâmina basal. Em músculos não feridos, os SCs estão principalmente presentes em um estado quiescente. Em resposta ao estresse ou lesão mecânica, os SCs se tornam ativados (mioblastos), proliferam e sofrem qualquer diferenciação para formar novas miofibras ou auto-renovação para reabastecer o SC pool ^{1 , 2} . Ao longo dos anos, várias técnicas foram desenvolvidas para isolar SCs e sua progênie, os mioblastos, a partir de biópsias de músculo esquelético. Com a maior compreensão dos marcadores de superfície celular expressados ​​nessas células e a metodologia de triagem celular ativada por fluorescência (FACS) ^{3, 4 , 5} , agora é possível isolar populações puras de mioblastos humanos a partir de amostras musculares.

A sinalização de cálcio rege o desenvolvimento do músculo esquelético, a homeostase e a regeneração. Em particular, a entrada Ca ²⁺ que é ativada após a depleção da loja intracelular, chamada SOCE, é de grande importância ⁶ para esses processos. Após a estimulação celular, o nível de Ca ^{2 +} no retículo endo / sarcoplasmático (ER / SR) diminui, o que, por sua vez, ativa os canais de Ca ^{2+ da} membrana plasmática que permitem a entrada de Ca ²⁺ para reabastecer o ER / SR ⁷ . As duas principais proteínas envolvidas em SOCE são a proteína 1 (STIM1) da molécula de interação estromal sensível ao ER / SR Ca ^{2 +} e o canal Ca ^{2+ da} membrana plasmática Orai1. O músculo esquelético expressa abundantemente essas duas proteínas, bem como outras proteínas das mesmas famílias (STIM2 aNd Orai2-Orai3) ^{8 , 9} e vários canais permeáveis ​​a Ca ²⁺ da família canônica potencial de receptor transitório (TRPC) ^{10 , 11 , 12 , 13} . A entrada de Ca ²⁺ através da via SOCE é de grande importância para a formação / regeneração muscular ¹⁴ . As mutações das proteínas STIM1 ou Orai1 têm efeitos deletérios sobre a função muscular, levando principalmente a hipotonia muscular ¹⁵ . Modelos de animais com deficiência de SOCE também apresentam massa muscular reduzida e força, juntamente com uma fatigabilidade melhorada ^{6 , 16 , 17} . Como mencionado, outras proteínas STIM e Orai, bem como muitos canais TRPC, são expressas no músculo esquelético, e seus respectivos papéis não foram determinados até agora. Ao bater dPossuem seu nível de expressão, é possível investigar suas implicações na SOCE e seus papéis durante a diferenciação muscular do esqueleto humano.

A medição de SOCE pode ser realizada usando duas abordagens diferentes: gravações eletrofisiológicas atuais e medições de Ca ²⁺ . A eletrofisiologia é certamente um método mais direto, pois mede a atualidade de interesse e sua assinatura eletrofisiológica associada. No entanto, esta técnica é muito difícil de aplicar às células musculares, principalmente devido ao grande tamanho das células musculares e ao pequeno tamanho da corrente endógena da SOCE. A imagem citosólica do Ca ^{2 +} é tecnicamente muito acessível, mas a medida é mais indireta, pois o nível de Ca ²⁺ medido no citosol reflete tanto a entrada de Ca ^{2 +} quanto o re-bombeamento da célula ou nas lojas internas.

Uma metodologia que inclui a isolação de mioblastos de pequenos pedaços de skel humanoO músculo etal após digestão enzimática, amplificação e FACS é explicado neste artigo. O processo de diferenciação muscular e o protocolo de imunofluorescência para seguir a expressão de marcadores de diferenciação ao longo do tempo são descritos ¹⁸ . Finalmente, são explicadas as medidas de SOCE e o papel de diferentes canais de íons na sinalização de Ca ^{2 +} e diferenciação muscular esquelética.