רומן חדש פאט שומן טכניקת השתלת לדמיין את כלי השיט הדור של כלי הדם בתאי גזע אנדותל
Summary
עבודה זו מדגימה גישה חדשנית להעריך את התפשטות, הבחנה, ואת היכולת להרכיב פוטנציאל של תאי גזע אנדותל כלי הדם (VESCs) באמצעות השתלת כרית שומן החלב ואחריו הכנת רקמות הר שלם עבור תצפית מיקרוסקופית. א השושלת מעקב אחר אסטרטגיה לחקור את ההתנהגות של VESCs in vivo מוצג גם.
Abstract
תאי האנדותל (ECs) הם אבני הבניין הבסיסיות של הארכיטקטורה הווסקולארית ותווך את צמיחת כלי הדם ואת שיפוץ כדי להבטיח פיתוח כלי תקין הומיאוסטזיס. עם זאת, מחקרים על היררכיה השושלת האנדותל להישאר חמקמק בשל היעדר כלים כדי לקבל גישה, כמו גם להעריך באופן ישיר את ההתנהגות שלהם in vivo . כדי לענות על חסרון זה, מודל רקמות חדש ללמוד אנגיוגנזה באמצעות כרית שומן החלב פותחה. בלוטת החלב מתפתחת בעיקר בשלבים שלאחר הלידה, כולל גיל ההתבגרות וההריון, שבמהלכם התפשטות האפיתל החזקה מלווה בשיפוץ נרחב של כלי הדם. שומני שומן החלב לספק שטח, מטריקס, עשירים אנגיוגניים גירויים מן האפיתל החלב גדל. יתר על כן, רפידות שומן החלב ממוקמות מחוץ חלל הצפק, מה שהופך אותם אתר השתלת נגיש בקלות להערכת פוטנציאל angiogenic של תאים אקסוגניים. עבודה זו מתארת גם יעילותNt מעקב הגישה באמצעות עכברים כתב פלואורסצנטי במיוחד התווית האוכלוסייה ממוקדת של תאי גזע אנדותל כלי הדם (VESCs) ב vivo . שיטה זו מעקב השושלת, יחד עם רקמות שלאחר מכן מיקרוסקופ הר שלם, לאפשר הדמיה ישירה של תאים ממוקד הצאצאים שלהם, שדרכו יכולת התפוצה ניתן לכמת את המחויבות בידול יכול להיות מיפוי גורל. באמצעות שיטות אלה, אוכלוסייה של Bipotent חלבון C קולטן (Procr) להביע VESCs זוהו לאחרונה במערכות כלי הדם מרובים. Procr + VESCs, המביא הן ECs חדשים pericytes, לתרום באופן פעיל אנגיוגנזה במהלך פיתוח, הומאוסטזיס, תיקון פציעה. בסך הכל, כתב היד הזה מתאר השתלה חדשה כרית שומן החלב ב vivo השושלת מעקב טכניקות שניתן להשתמש בהם כדי להעריך את תכונות תאי גזע של VESCs.
Introduction
במהלך הפיתוח והומיאוסטזיס, צמיחת כלי הדם ושיפוצם נאמנים בהתאם לצמיחת איברים ולתיקונם. אנגיוגנזה מתאר את הדור של כלי דם חדשים מכלי הדם הקיימים, ונחשב לכוח מרכזי המתווך את השינויים הדינמיים הדינמיים. כל כלי דם הוא פנימי שורות עם שכבת תאי האנדותל (ECs), והם נראים הבסיס של הארכיטקטורה כלי השיט. במשך זמן רב, המנגנון שדרכו הבריכה EC מתחדשת במהלך ההומיאוסטזיס נותרה לא ברורה, והועלו טיעונים על השאלה אם מחזור כלי הדם הוא תוצאה של התפשטות הבשלות האירופית או תרומת הפעילות של תאי גזע ו / או אב. בשל היעדר ראיות פיזיולוגיות ישירות, הקיום והזהות הסלולרית של תאי גזע אנדותליים (VESCs) נותרו גם הם שנויים במחלוקת.
אחת הגישות הנפוצות ביותר לאימות התנהגות תאי גזע היא באמצעות הטרנספלאןTation של תאי גזע putative לתוך עכברים מקבלי. שיטה זו מודדת את פוטנציאל הגזע של תאי גזע מועמדים in vivo. ההשתלה יושמה לראשונה על המחקר של תאי גזע של מח עצם 1 , אשר תרמו להקמת המאפיינים ההיררכיים של המערכת ההמטופויטית 2 . בתחום האנדותל, מטריצת קרום במרתף ( למשל, matrigel) תקע מוכנס תת עורי מתחת לעור האגף כבר תקן assay angiogenesis vivo בשימוש כדי להתמודד עם יכולות היווצרות כלי שיט של ECs המושתלים. שיטות ניסיוניות מרובות, כולל היווצרות המושבה במערכות תרבות 3D השתלה, הציעו אבות פוטנציאליים EC / אוכלוסיות VESC 3 , 4 , 5 , 6 . עם זאת, מאז ECs מוטבע במטריצה בממברנה במרתף נפרדים יחסיתהרקמה שמסביב, זה אינו מספק את הסביבה נישה אופטימלי הנדרש כדי לחקור את הפוטנציאל angiogenic של תאים המושתלים. כתוצאה מכך, כלי שנוצרו בתוך תקע המטריצה הם בעיקר נימיות כמו והם ניתנים למדידה באופן פונקציונלי.
בלוטת החלב מתפתחת לאחר הלידה, עם הצמיחה החזקה ביותר המתרחשת במהלך ההתבגרות וההריון. בשלב הבגרותי, האפיתל החלב עובר התרחבות מהירה, כדי לתפוס את כל פנקס השומן החלב, מלווה שיפוץ יעיל של מבנים וסקולריים שמסביב. לפיכך, בלוטת החלב מציעה מודל מצוין לחקר אנגיוגנזה. הוא מספק מרחב, מטריקס ועשירים גירויים אנגיוגניים מן האפיתל החלב גדל ולכן הוא אתר השתלת אידיאלי להערכת פוטנציאל angiogenic של תאים אקסוגניים. בנוסף, פנקס שומן החלב מאפשר כלי אקסוגניים נוצרו להשתלב עם מערכת מחזור המארחת, ומאפשר f נוספתהערכה לא-פונקציונלית ומייצגת יתרון על פני השתלות תת-עורית.
למרות מבחני culturing והשתלות במבחנה הם דרך יעילים כדי לחקור את מאפייני ההתחדשות של אוכלוסיית תא, ידוע כי מבחנים כזה עלולים לעורר פלסטיות כתאים נלקחים מן הגידול הטבעי שלהם, ושינויים עלולים להיגרם כאשר תאים מנותקים הסביבה הפיזיולוגית שלהם 7 . לכן, קבלת ראיות ישירות vivo גורל התא היא הגישה העיקרית לקידום ההבנה הנוכחית של ההתנהגות של אוכלוסיות האנדותל.
מיפוי גורל גנטי ( כלומר, ב vivo השושלת מעקב) הוא הכרחי לזיהוי של VESCs ו לחקירת תכונותיהם במערכת הגוף, כפי שהוא יכול לגלות התנהגות התא גזע vivo בהקשר הפיזיולוגי שלה, ואת הגזע בפועל יכול להיות מוֹעֳרָך. השושלתNg מספק ראיות ישירות להתמדה ארוכת הטווח ( כלומר, התחדשות עצמית) של VESCs המועמדים ויכולתם לייצר סוגי תאים עבור רקמת המוצא ( כלומר, כוח ההבחנה).
פרוטוקול זה מתאר רומן חזה רומן חדש השתלת טכניקה שיטת השושלת השורש כדי לבחון את יכולת ייצור כלי של VESCs. טכניקות אלה להתגבר על חסרונות של מבחני זמין כיום ולספק דרך חדשה כדי להעריך באופן אופטימלי את תכונות תאי גזע של VESCs. גישות אלה הם כלים יעילים שניתן להשתמש בהם כדי להעריך את ההתנהגות ואת כלי יצירת המאפיינים של אוכלוסיות האנדותל, כמו גם לקבוע שינוי פוטנציה תא כוח כלי הדם בתוך סביבה פתולוגית.
Protocol
Representative Results
Discussion
מבחני אנגיוגנזה מייצגים גישה ניסויית טובה לדינמיקה של כלי הדם. עכבר הרשתית של הרשתית, המתפתח לאחר הלידה, הוכח כמודל אטרקטיבי ללימוד אנגיוגנזה 12 . למרות היותו נגיש יחסית, מניפולציה בפועל בתוך המיטה הרשתית הרשתית היא די קשה. עד כה, המתואר הכי טוב ב השתל…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (31530045 ו- 31371500 ל- YAZ, 31401245 ל- QCY), משרד המדע והטכנולוגיה של סין (2014CB964800), האקדמיה הסינית למדעים (XDB19000000 ל- YAZ) והסינים חברה לביולוגיה של התא (מלגות מוקדמות לקריירה).
Materials
| 0.05% Trypsin-Ethylene Diamine Tetraacetic Acid(EDTA) (1X) | Gibco (Life Technologies) | 25300-062 | 0.05% Trypsin |
| 0.22 µm Filter Unit | Merck Millipore Ltd. | SLGP033RB | 0.22 µm Filter |
| 2-Methylbutanol-2, ReagentPlus | Sigma-Aldrich | 24, 048-6 | Tert Amyl Alcohol |
| 222, Tribromethanol | Sigma-Aldrich | T48402-25g | 222, Tribromethanol |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI) | Invitrogen | D1306 | DAPI |
| 70 µm Cell Strainer | BD FAL | 352350 | 70 µm Cell Strainer |
| Adhesion Microscope Slides | CITOGLAS | 188105 | Glass slides |
| Anti-mouse CD105 APC | eBioscience | 17-1051-82, clone MJ7/18 | for FACS analusis use at 1 µg/mL |
| Anti-mouse CD201 Biotin | eBioscience | 13-2012-82 | for FACS analusis use at 2.5 µg/mL |
| Anti-mouse CD31 PE-Cyanine 7 | eBioscience | 25-0311-82, clone 390 | for FACS analusis use at 1 µg/mL |
| BD FACSJazz Cell Sorter | BD Biosciences | 655489 | FACS |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | 100190332 | BSA |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Centrifuge |
| Collagenase type 3 | Worthington-Biochem | #LS004183 | Collagenase III |
| Confocal microscopy | Leica | sp8 | Confocal |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D2463-5VL | Dnase I |
| Donkey anti-Rat Cy3 | Jackson ImmunResearch | 712-165-150 | Secondary antibody, use at 0.5 µg/mL |
| Dumont Forceps | WPI | 500342 | Froceps |
| Dumont Forceps – Micro-Blunted Tips | FST | 11253-20 | Forceps |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | FBS |
| FITC Ms CD3/Gr1/CD11b/CD45R(B220)/Ter-119 | BioLegend | 78022 | Blood lineage cocktail for FACS analysis, use at 25 µl per test |
| Glycerol | Sigma | G6279 | Glycerol |
| Iscov's Modified Dulbecco's Medium | Gibco (Life Technologies) | 12440-053 | IMDM |
| Isolectin GS-IB4 from Griffonia Simplicifolia, Alexa Fluora 647 | Invitrogen | Z32450 | Isolectin-647 |
| Matrigel Matrix (growth factor reduced) | BD | 356231 | Matrigel |
| Mouse strain (Actin-GFP) | Jax Laboratories | 3773 | Actin-GFP |
| Mouse strain (C57BL/6) | SLAC | C57BL/6 | C57BL/6 |
| Mouse strain (BALB/c nude) | SLAC | BALB/c nude | Nude mice |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | PFA |
| Penicilin Streptomycin | Gibco (Life Technologies) | 5140-122 | Pen/Strep |
| Phosphate Buffered Saline (pH7.2) 1X | Gibco (Life Technologies) | c20012500BT | PBS |
| PRIM1640 | Gibco (Life Technologies) | c11875500CP | PRIM1640 |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | Mounting Medium |
| Rat anti CD144 | BD Biosciences | 550548 | for whole-mount analysis, anti-VE-Cadherin / Cdh5 antibdy for endothelial tight junction, use at 2.5 µg/mL |
| Rat anti CD31-biotin | BD Biosciences | 553371 | for whole-mount analusis, anti-CD31/PECAM1 antibody for endothelial surface adhesion molecule, use at 10 ug/mL |
| Red Cell Lysis Buffer | Sigma | R7767-100ML | Red blood cell lysing buffer |
| Straight/Sharp-Blunt/10cm | FST | 14028-10 | Fine Scissors |
| Streptavidin eFluor 450 | eBioscience | 48-4317-82 | for FACS analysis use at 0.5 µg/mL |
| Tamoxifen | Sigma | 101551374 | TAM |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-250ML | TritonX |
| Wax Coated Braided Silk (Size 5-0 USP (1 Metric), 18 inches (45 cm) BLACK on C-1 Needle) | COVIDIEN | S1173 | Suture |
| Sterile Disposable Scaplels | Swann Morton | #10 | Scalpel |
| Betadine | Yifeng Medical | 20160101 | Antiseptic solution |
References
- Thomas, E. D., Lochte, H. L., Lu, W. C., Ferrebee, J. W. Intravenous infusion of bone marrow in patients receiving radiation and chemotherapy. N Engl J Med. 257 (11), 491-496 (1957).
- Chao, M. P., Seita, J., Weissman, I. L. Establishment of a normal hematopoietic and leukemia stem cell hierarchy. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 73, 439-449 (2008).
- Bompais, H., et al. Human endothelial cells derived from circulating progenitors display specific functional properties compared with mature vessel wall endothelial cells. Blood. 103 (7), 2577-2584 (2004).
- Fang, S., Wei, J., Pentinmikko, N., Leinonen, H., Salven, P. Generation of functional blood vessels from a single c-kit+ adult vascular endothelial stem cell. PLoS Biol. 10 (10), e1001407 (2012).
- Naito, H., Kidoya, H., Sakimoto, S., Wakabayashi, T., Takakura, N. Identification and characterization of a resident vascular stem/progenitor cell population in preexisting blood vessels. EMBO J. 31 (4), 842-855 (2012).
- Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).
- Snippert, H. J., Clevers, H. Tracking adult stem cells. Embo Rep. 12 (2), 113-122 (2011).
- Yu, Q. C., Song, W., Wang, D., Zeng, Y. A. Identification of blood vascular endothelial stem cells by the expression of protein C receptor. Cell Res. 26 (10), 1079-1098 (2016).
- Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland. Nature. 506, 322-327 (2014).
- Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449, 1003-1007 (2007).
- Wang, D. S., et al. Identification of multipotent mammary stemcells by protein C receptor expression. Nature. 517, 81-U201 (2015).
- Stahl, A., et al. The Mouse Retina as an Angiogenesis Model. Invest Ophth Vis Sci. 51 (6), 2813-2826 (2010).
- Mammoto, T., Mammoto, A. Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis. J. Vis. Exp. (94), e52012 (2014).
- Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143 (1), 134-144 (2010).
- Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat Genet. 21 (1), 70-71 (1999).
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Solar, M., et al. Pancreatic exocrine duct cells give rise to insulin-producing beta cells during embryogenesis but not after birth. Dev Cell. 17 (6), 849-860 (2009).
