В этом методе мы представляем биохимические процедуры для быстрого и эффективного выделения промежуточных филаментных (IF) белков из нескольких тканей мыши. Изолированные IFs можно использовать для изучения изменений посттрансляционных модификаций с помощью масс-спектрометрии и других биохимических анализов.
Промежуточные филаменты (IFs) вместе с актиновыми филаментами и микротрубочками образуют цитоскелет – критический структурный элемент каждой клетки. Нормальные функционирующие ИФ обеспечивают клетки механической и стрессовой устойчивостью, в то время как нефункциональный цитоскелет IF ставит под угрозу здоровье клеток и связан со многими заболеваниями человека. Посттрансляционные модификации (ПТМ) критически регулируют динамику ПЧ в ответ на физиологические изменения и в стрессовых условиях. Таким образом, способность контролировать изменения в сигнатуре ПТФ ПЧ может способствовать лучшему функциональному пониманию и, в конечном счете, кондиционированию системы ПЧ в качестве ответчика на стресс при клеточном повреждении. Тем не менее, большое количество IF-белков, которые кодируются более чем 70 отдельными генами и экспрессируются тканезависимым образом, является основной проблемой при определении относительной важности различных ПТМ. С этой целью методы, которые позволяют контролировать ПТМ на белках ПЧНа общесистемном уровне, а не на отдельных членов семьи, может ускорить прогресс исследований в этой области. Здесь мы представляем биохимические методы для выделения полной, детергент-растворимой и устойчивой к моющим средствам фракции IF-белков из 9 различных тканей мыши (мозг, сердце, легкие, печень, тонкая кишка, толстая кишка, поджелудочная железа, почка и селезенка). Далее мы демонстрируем оптимизированный протокол для быстрой изоляции IF-белков с использованием лизирующей матрицы и автоматической гомогенизации различных тканей мыши. Автоматизированный протокол полезен для профилирования ИФ в экспериментах с большим объемом выборки (например, в моделях болезней с участием нескольких животных и экспериментальных групп). Полученные в результате образцы могут быть использованы для различных анализов ниже по течению, включая масс-спектрометрическое профилирование PTM. Используя эти методы, мы предоставляем новые данные, чтобы показать, что белки IF в различных тканях мыши (мозг и печень) подвергаются параллельным изменениям в отношении их экспрессийУровня и ПТМ во время старения.
IFS – это семейство белков, которые у людей кодируются 73 генами и подразделяются на шесть основных типов: типы I-IV являются цитоплазматическими ( например, эпителиальные и волосяные кератины (K), миоцит-десмин, нейрофиламенты, глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP) и другие); Тип V – ядерные слои; И тип VI являются ПЧ в глазной линзе 1 . С точки зрения их молекулярной организации, белки IF имеют три общие области: высококонсервативный спиральный «стержневой» домен и шаровые «голова» и «хвостовой» домен. IF-тетрамеры белка собираются с образованием коротких нитевидных предшественников, которые в конечном счете внедряются в зрелые волокна, которые формируют динамические цитоскелетные и нуклеоскелетные структуры, участвующие в механической защите 2 , чувствительность к стрессу 3 , 4 , регуляцию транскрипции 5 и рост и другие критические клеточные функции"> 1 , 6 , 7 .
Функциональное значение IF-системы подчеркивается наличием многих заболеваний человека, вызванных missense мутациями в IF-генах, включая невропатии, миопатии, расстройства хрупкости кожи, метаболические дисфункции и синдромы преждевременного старения 8 . Некоторые мутации гена IF не вызывают, но предрасполагают их носителей к прогрессированию болезни, таким как простые эпителиальные кератины при болезни печени 9 . Последнее связано с критическими стресс-защитными функциями ИФ в эпителии. IFS в общем случае являются одними из наиболее распространенных клеточных белков в базальных условиях, но дополнительно сильно индуцируются при различных типах стресса 10 . Например, недавние исследования, оценивающие изменения в широком диапазоне протеомов у нематод C. elegans, показали, что множественные IFs сильно активируются и склонны к агрегатамВо время старения организма 11 , 12 . Поскольку поддержание надлежащей структуры IF важно для устойчивости клеток к различным формам стресса 10 , агрегация IF также может способствовать функциональному снижению во время старения. Однако исследования на организменном уровне, изучающие множественные IF-протеины млекопитающих в разных тканях, подвергающихся стрессу, отсутствуют.
IFs – это высокодинамичные структуры, которые адаптируются к требованиям сотовой связи. Кератины, например, подвергаются независимой от биосинтеза циклизации между растворимым (неволокнистым) и нерастворимым (нитевидным) пулом 13 протеинов. При нормальных физиологических условиях приблизительно 5% общий объем пула K8 / K18 может быть экстрагирован в буфере без моющих средств по сравнению с приблизительно 20%, который может быть солюбилизирован в неионном детергенте Nonidet P-40, который биохимически сравним с Triton- X100 14 , </sВверх> 15 . Во время митоза наблюдается заметное увеличение растворимости эпителия K8 и K18 14 простого типа, которое менее выражено в эпидермальных кератинах, но более выражено у виментина и других IF-белков III типа 15 , 16 . Свойства растворимости IF-белков жестко регулируются путем фосфорилирования, ключевой посттрансляционной модификации (PTM) для перегруппировки филаментов и их растворимости 17 , 18 , 19 , 20 . Большинство ПЧ подвергаются широкому регулированию рядом ПТМ на консервативных участках, что приводит к функциональным изменениям 17 .
Цель этого метода заключается в том, чтобы ввести исследователей, которые являются новичками в области ИФ, к биохимическим экстракционным и аналитическим методам исследования IF-протеинов в нескольких тканях мыши. КонкретныйМы сосредотачиваемся на выделении белков IF, используя метод экстракции с использованием соли и оценку изменений в PTM с помощью масс-спектрометрии и PTM-нацеливающих антител. Эти методы основаны на ранее опубликованных процедурах 21, но включают модификации для извлечения различных типов белка IF, чтобы выявить общий механизм регуляции в IF-семействе. Например, ацетилирование K8 в определенном лизиновом остатке регулирует организацию нитей, тогда как гиперацетилирование способствует нерастворимости K8 и образованию агрегатов 22 . Недавние глобальные исследования протеомного профилирования дополнительно показали, что большинство тканеспецифичных IF-белков также являются мишенями для ацетилирования и что большинство сайтов ацетилирования IF ограничено высококонсервативным доменом палочек. Это подчеркивает необходимость в методах, подходящих для глобального профилирования системы IF. Мы также вводим быстрый метод выделения белков IF из нескольких тканей с использованием автоматической гомогенизации в optiЛизиновая матрица. Полученные препараты пригодны для последующего анализа ПТМ с помощью масс-спектрометрии и других методов.
Методы, которые позволяют биохимическую характеристику IF-белков, могут быть полезны для понимания многочисленных патофизиологических явлений в системах млекопитающих, поскольку IF-белки являются маркерами и модуляторами клеточного и тканевого стресса 29 . Принцип, лежащи…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана грантами NIH NIH R01 DK110355, DK093776 [NTS], DK102450 [NTS] и P30 DK034987 [в UNC-Chapel Hill]. Авторы благодарят Deekshita Ramanarayanan за помощь в qPCR и вестерн-блот-экспериментах.
Dynabeads Protein G | ThermoFisher Scientific | 10009 | immunoprecipitation beads |
PBS | ThermoFisher Scientific | 10010049 | for buffers |
Purelink RNA mini kit | ThermoFisher Scientific | 12183018 | RNA extraction from tissue |
Purelink DNAse set | ThermoFisher Scientific | 12185010A | on column DNA digestion |
Dynamag-2 | ThermoFisher Scientific | 12321D | magnet for use with dynabeads |
GelCode Blue Stain Reagent | ThermoFisher Scientific | 24592 | mass spectrometry-compatible gel stain |
Pierce ECL Western Blotting Substrate | ThermoFisher Scientific | 32106 | for use in western blot |
High Capacity cDNA reverse transcription kit | ThermoFisher Scientific | 4368813 | for use in gene expression analysis |
Proflex 3×32-well PCR System | ThermoFisher Scientific | 4484073 | PCR system |
PVDF transfer membrane | ThermoFisher Scientific | 88520 | for western blot |
Power Up SYBR master mix | ThermoFisher Scientific | A25778 | for qPCR analysis |
RNAlater | ThermoFisher Scientific | AM7020 | solution for tissue storage prior to RNA isolation |
Novex 4-20% Tris Glycine Gel | ThermoFisher Scientific | XP04205BOX | Precast protein gel |
Anti-Keratin 8 antibody (TS1) | ThermoFisher Scientific | MA514428 | for western blot detection of K8 |
Anti-Vimentin | ThermoFisher Scientific | MA511883 | for western blot detection of vimentin |
Tris Glycine Transfer Buffer (25X) | ThermoFisher Scientific | LC3675 | for wet transfer of protein gels |
2X SDS Sample Buffer | ThermoFisher Scientific | LC2676 | for preparing protein gel samples |
Tris Glycine SDS Running Buffer (10X) | ThermoFisher Scientific | LC26755 | for running protein gels |
Lysing beads – Matrix D | MP Biomedicals | 116913100 | Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and RNA extraction |
Lysing beads – Matrix SS | MP Biomedicals | 116921100 | Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and protein extraction |
NanoDrop Lite Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-LITE | measurement of protein and nucleic acid |
Precellys 24 homogenizer | Bertin Instruments | EQ03119 | Automated tissue homogenizer |