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生物化学

노화 관련 post-translational 수정을 공부하기 위해 여러 마우스 조직에서 중간 필라멘트 단백질의 분리

Published: May 18, 2017
doi:
10.3791/55655
, , , ,
1Department of Cell Biology and Physiology, School of Medicine,University of North Carolina at Chapel Hill

Summary

이 방법에서는 여러 개의 마우스 조직에서 중간 필라멘트 (IF) 단백질을 신속하고 효율적으로 분리하기위한 생화학 적 절차를 제시합니다. 분리 된 IF는 질량 분광법 및 기타 생화학 적 분석법에 의한 번역 후 변형의 변화를 연구하는데 사용될 수 있습니다.

Abstract

중급 필라멘트 (IF)는 액틴 필라멘트 및 미세 소관과 함께 모든 세포의 중요한 구조 요소 인 세포 뼈대를 형성합니다. 정상 기능 IFs는 세포에 기계적 및 응력 복원력을 제공하는 반면 기능 장애 IF 세포 뼈대는 세포 건강을 손상시키고 많은 인간 질병과 관련이 있습니다. 생체 변화 및 스트레스 조건에 따라 IF 역학을 비판적으로 조절합니다. 따라서 IF의 PTM 시그니처의 변화를 모니터링하는 능력은 세포 손상 동안 스트레스 리스폰 더로서의 IF 시스템의 더 나은 기능적 이해 및 궁극적으로 컨디셔닝에 기여할 수 있습니다. 그러나, 70 개 이상의 개별 유전자에 의해 암호화되고 조직에 의존적 인 방법으로 표현되는 많은 수의 IF 단백질은 다른 PTM의 상대적인 중요성을 분류하는 데있어 주요한 과제입니다. 이를 위해 IF 단백질에서 PTM을 모니터링 할 수있는 방법고립 된 가족 구성원이 아닌 유기체 차원에서이 분야의 연구 진행을 가속화 할 수 있습니다. 여기에 우리는 9 개의 다른 마우스 조직 (뇌, 심장, 폐, 간, 소장, 대장, 췌장, 신장 및 간세포)에서 IF 단백질의 전체, 세제 가용성 및 세제 내성 분획을 분리하는 생화학 적 방법을 제시합니다 비장). 우리는 lysing 매트릭스와 다른 마우스 조직의 자동화 균질화를 사용하여 IF 단백질의 신속한 분리를위한 최적화 된 프로토콜을 입증합니다. 자동화 된 프로토콜은 높은 샘플 양 (예 : 여러 동물 및 실험 그룹이 포함 된 질병 모델)이있는 실험에서 IF를 프로파일 링하는 데 유용합니다. 결과 샘플은 질량 분석 기반 PTM 프로파일 링을 포함한 다양한 다운 스트림 분석에 활용할 수 있습니다. 이 방법들을 이용하여, 우리는 다른 마우스 조직 (뇌 및 간)에있는 IF 단백질이 그들의 표현과 관련하여 평행 한 변화를 겪는다는 것을 보여주는 새로운 데이터를 제공한다시온 (sion) 수준 및 PTMs.

Introduction

IFs는 인간에서 73 개의 유전자로 코드화되며 여섯 가지 주요 유형으로 분류되는 단백질 군입니다. 유형 I-IV는 세포질 ( 예 : 상피와 모발 케라틴 (K), 근육 세포 데민 (amocyte desmin), 신경 섬유 (neurofilaments), 신경 교세포 성 산성 단백질 (GFAP) 다른 사람); type V는 핵 라미네이트입니다. 및 VI 형은 눈 렌즈 ( 1) 에서 IF이다. 분자 구조면에서 보면, IF 단백질은 크게 보존 된 코일 형 코일 "막대"도메인과 구형 "머리"및 "꼬리"도메인의 세 가지 공통 도메인을 가지고 있습니다. IF 단백질 4 량체는 조립되어 짧은 필라멘트 전구체를 형성하며 궁극적으로는 성숙 필라멘트에 결합되어 기계적 보호에 관련된 동적 세포 골격 및 핵 골격 구조를 형성 2 , 스트레스 센싱 3 , 4 , 전사 5 조절 및 성장 및 기타 중요한 세포 기능"> 1 , 6 , 7 .

IF 시스템의 기능적 중요성은 신경 병증, 근육 병증, 피부 허약 장애, 대사 기능 장애 및 조기 노화 증후군을 포함하여 IF 유전자의 미스 돌연변이로 인한 많은 인간 질병의 존재에 의해 강조됩니다. 일부 IF 유전자 돌연변이는 간 질환 9 의 단순한 상피 각질과 같은 병의 진행을 야기하지는 않지만 캐리어를 질병에 걸리기 쉽게 만든다. 후자는 상피 세포에서 IF의 중요한 스트레스 – 보호 기능에 기인한다. IFs는 일반적으로 기저 조건 하에서 가장 풍부한 세포 단백질 중 하나이지만, 다양한 유형의 스트레스 중에 더욱 강하게 유도됩니다 10 . 예를 들어 선충류 C. elegans 의 프로테옴 전반에 걸친 변화를 평가 한 최근의 연구에 따르면 여러 IF가 고도로 상향 조절되고 응집되기 쉬운 것으로 나타났습니다유기체 노화 동안 11 , 12 . 적절한 IF 구조의 유지가 다양한 형태의 스트레스에 대한 세포 내성에 필수적이기 때문에, IF 응집 또한 노화 동안 기능 저하에 기여할 수있다. 그러나 스트레스를받는 여러 조직에서 여러 포유류 IF 단백질을 검사하는 유기체 수준의 연구가 부족합니다.

IF는 세포의 요구를 충족시키기 위해 적응하는 매우 역동적 인 구조입니다. 예를 들어, 케라틴은 용해성 (비 섬유 성)과 불용성 (섬유 성) 단백질 풀 사이의 생합성과 무관 한 순환을 거친다. 정상적인 생리 조건에서 총 K8 / K18 풀의 약 5 %는 트리톤 (non-ionic) 세제 인 Nonidet P-40에서 가용화 될 수있는 약 20 %와 비교하여 세제가없는 완충액에서 추출 될 수 있습니다. X100 14 , </s> 15 . 유사 분열 중에는 표피 각질에서 덜 명백하지만 vimentin 및 기타 III 형 IF 단백질에서 더 뚜렷한 단순형 상피 K8 및 K18 14 의 용해도가 현저히 증가합니다 15,16. IF 단백질의 용해도 특성은 필라멘트 재 배열 및 용해성을위한 주요 번역 후 변형 (PTM) 인 인산화에 의해 엄격하게 조절됩니다 17 , 18 , 19 , 20 . 대부분의 IF는 보존 된 장소에서 다수의 PTM에 의해 광범위한 규제를 받아 기능적 변화가 일어납니다 17 .

이 방법의 목적은 여러 가지 마우스 조직에서 IF 단백질 연구를위한 생화학 적 추출 및 분석 방법에 대해 IF 분야에 처음으로 연구자를 소개하는 것입니다. 특유한우리는 고염 추출법을 사용하여 IF 단백질을 분리하고 질량 분광기 및 PTM 표적 항체를 통해 PTM의 변화를 평가하는 데 초점을 맞 춥니 다. 이 방법은 이전에 발표 된 절차를 바탕으로하지만 IF 가족 전체의 규제에 대한 일반적인 메커니즘을 밝히기 위해 다양한 IF 단백질 유형을 추출하기위한 수정을 포함합니다. 예를 들어 특정 라이신 잔기의 K8 아세틸 화는 필라멘트 구성을 조절하는 반면과 아세틸 화는 K8 불용성 및 응집체 형성을 촉진합니다 22 . 최근의 세계적 proteomic 프로파일 링 연구는 또한 대부분의 조직 특이적인 IF 단백질이 또한 아세틸 화의 표적이며 대부분의 IF 아세틸 화 부위가 고도로 보존 된로드 도메인에 국한됨을 보여 주었다. 이는 IF 시스템의 글로벌 프로파일 링에 적합한 방법의 필요성을 강조합니다. 우리는 또한 opti에서 자동 균질화를 사용하여 여러 조직에서 IF 단백질을 단리하는 신속한 방법을 소개합니다mized lysing matrix. 생성 된 준비물은 질량 분광법 및 기타 방법을 통한 다운 스트림 PTM 분석에 적합합니다.

Protocol

이 프로토콜은 노스 캐롤라이나 대학 (University of North Carolina)의 기관 동물 케어 및 사용위원회 (IACUC)에 따라 승인되고 수행됩니다. 1. 준비 사항 트리톤 -X 버퍼 (1 % 트리톤 X-100, 5mM 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA), 인산염 완충 생리 식염수 (PBS), pH 7.4)를 준비한다. 500 mL를 만들려면 Triton X-100과 500 mM EDTA 각각 5 mL를 PBS 490 mL, pH 7.4에 넣으십시오. 4 ℃에서 Triton-X 완충 용액을 보관하?…

Representative Results

lysing matrix를 이용한 다중 마우스 조직으로부터 IF 단백질의 고염 기반 추출을위한 새로운 신속한 방법. 상피 조직으로부터 중간 필라멘트 단백질 분획의 대량을 분리하는 전통적인 방법 25 , 26 은 9 개의 다른 기관을 포함하고 조직 용해를?…

Discussion

IF 단백질이 생체 화학적 특성을 나타낼 수있는 방법은 IF 단백질이 세포 및 조직 스트레스의 마커이자 모듈레이터이기 때문에 포유류 시스템에서 수많은 병태 생리 현상을 이해하는 데 유용합니다. 현재의 방법 뒤에있는 원리는 일반적으로 저염소 용액과 고염 용액을 사용하는 세포와 조직으로부터 IF 단백질을 분리, 분리 및 재구성하기위한 1970 년대와 1980 년대에 개발 된 초기 절차를 토대로하?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 NIH R01 DK110355, DK093776 [NTS], DK102450 [NTS] 및 P30 DK034987 [UNC-Chapel Hill에]의 NIH 교부금으로 지원되었습니다. 저자는 qPCR 및 웨스턴 블랏 실험에 대한 도움을 주신 Deekshita Ramanarayanan에게 감사드립니다.

Materials

Dynabeads Protein G ThermoFisher Scientific 10009 immunoprecipitation beads
PBS ThermoFisher Scientific 10010049 for buffers
Purelink RNA mini kit ThermoFisher Scientific 12183018 RNA extraction from tissue
Purelink DNAse set ThermoFisher Scientific 12185010A on column DNA digestion
Dynamag-2 ThermoFisher Scientific 12321D magnet for use with dynabeads
GelCode Blue Stain Reagent ThermoFisher Scientific 24592 mass spectrometry-compatible gel stain
Pierce ECL Western Blotting Substrate ThermoFisher Scientific 32106 for use in western blot
High Capacity cDNA reverse transcription kit ThermoFisher Scientific 4368813 for use in gene expression analysis
Proflex 3×32-well PCR System ThermoFisher Scientific 4484073 PCR system
PVDF transfer membrane  ThermoFisher Scientific 88520 for western blot
Power Up SYBR master mix ThermoFisher Scientific A25778 for qPCR analysis
RNAlater ThermoFisher Scientific AM7020 solution for tissue storage prior to RNA isolation
Novex 4-20% Tris Glycine Gel ThermoFisher Scientific XP04205BOX Precast protein gel
Anti-Keratin 8 antibody (TS1) ThermoFisher Scientific MA514428 for western blot detection of K8
Anti-Vimentin ThermoFisher Scientific MA511883 for western blot detection of vimentin
Tris Glycine Transfer Buffer (25X) ThermoFisher Scientific LC3675 for wet transfer of protein gels
2X SDS Sample Buffer ThermoFisher Scientific LC2676 for preparing protein gel samples
Tris Glycine SDS Running Buffer (10X) ThermoFisher Scientific LC26755 for running protein gels
Lysing beads – Matrix D MP Biomedicals 116913100 Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and RNA extraction
Lysing beads – Matrix SS MP Biomedicals 116921100 Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and protein extraction
NanoDrop Lite Spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND-LITE measurement of protein and nucleic acid
Precellys 24 homogenizer Bertin Instruments EQ03119 Automated tissue homogenizer
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Battaglia, R. A., Kabiraj, P., Willcockson, H. H., Lian, M., Snider, N. T. Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications. J. Vis. Exp. (123), e55655, doi:10.3791/55655 (2017).
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