Histologische Analysen der akuten alkoholischen Leberverletzung in Zebrafisch
Summary
Dieses Protokoll beschreibt histologische Analysen der Leber aus Zebrafisch-Larven, die mit 2% Ethanol für 24 Stunden behandelt wurden. Eine solche akute Ethanolbehandlung führt zu einer hepatischen Steatose und einer Schwellung des Lebergefäßsystems.
Abstract
Alkoholische Lebererkrankung (ALD) bezieht sich auf Schädigung der Leber durch akuten oder chronischen Alkoholmissbrauch. Es gehört zu den führenden Ursachen für alkoholbedingte Morbidität und Mortalität und betrifft mehr als 2 Millionen Menschen in den Vereinigten Staaten. Ein besseres Verständnis der zellulären und molekularen Mechanismen, die der Alkohol-induzierten Leberverletzung zugrunde liegen, ist entscheidend für die Entwicklung einer effektiven Behandlung für ALD. Zebrafisch-Larven zeigen hepatische Steatose und Fibrogenese nach nur 24 h Exposition gegenüber 2% Ethanol, so dass sie nützlich für die Untersuchung der akuten alkoholischen Leberverletzung. Diese Arbeit beschreibt das Verfahren für die akute Ethanolbehandlung in Zebrafischlarven und zeigt, dass es eine Steatose und Schwellung der Leberblutgefäße verursacht. Ein detailliertes Protokoll für Hämatoxylin- und Eosin- (H & E) -Färbung, das für die histologische Analyse der Zebrafisch-Larvenleber optimiert ist, wird ebenfalls beschrieben. H & E-Färbung hat mehrere einzigartige Vorteile gegenüber der Immunfluoreszenz, da sie alle liv markiertEr-Zellen und extrazellulären Komponenten gleichzeitig und kann leicht erkennen Leber-Verletzungen, wie Steatose und Fibrose. Angesichts der zunehmenden Verwendung von Zebrafisch bei der Modellierung von Toxin und Virus-induzierter Leberverletzung sowie vererbter Lebererkrankungen dient dieses Protokoll als Referenz für die histologischen Analysen, die in all diesen Studien durchgeführt wurden.
Introduction
Alkoholische Lebererkrankung (ALD), die durch Alkoholüberkonsum verursacht wird, ist eine Hauptursache für alkoholbedingte Morbidität und Mortalität. In den Vereinigten Staaten, fast die Hälfte der Leberkrankheit Todesfälle beinhalten Alkohol 1 , und ALD ist verantwortlich für fast 1 in 3 Lebertransplantationen 2 . ALD hat ein breites Spektrum. Die Steatose, die durch eine überschüssige Lipidakkumulation in Hepatozyten charakterisiert ist, tritt im frühen Stadium des schweren Trinkens auf und ist bei Beendigung des Alkoholkonsums reversibel. Unter dem Einfluss von genetischen und umweltbedingten Faktoren und der anhaltenden Alkoholkonsum kann die hepatische Steatose zur alkoholischen Hepatitis und schließlich zur Zirrhose führen. Studien mit dem Nagetier ALD-Modelle haben erhebliche Einblicke in die Krankheit, aber sie haben Einschränkungen (siehe Referenz 3 ). Mündliche Fütterung einer Alkohol-Diät verursacht nur Steatose bei Nagetieren 4 , </ Sup> 5 Entwicklung von Entzündungen und Fibrose erfordert entweder eine zweite Beleidigung 6 , 7 oder chronische intragastrischen Infusion, die invasiv und technisch anspruchsvoll ist 8 , 9 . Der Zeolith des Zeoliths erzeugt auch eine Leberverletzung als Reaktion auf die chronische und akute Alkoholbehandlung 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 . Insbesondere stellt der Larven-Zebrafisch einen attraktiven komplementären Modellorganismus dar, in dem akute alkoholische Leberverletzungen 10 , 11 , 13 , 15 untersucht werden können . Die Zebrafisch-Leber ist funktionell und produziert Schlüsselenzyme für den Ethanol-Stoffwechsel um 4 TageNach der Befruchtung (dpf) 13 , 16 , 17.Ethanol kann direkt dem Wasser zugesetzt werden, und die Exposition gegenüber 2% Ethanol für 24 h ist ausreichend, um hepatische Steatose und fibrogene Reaktionen in Zebrafischlarven 13 , 15 zu induzieren.
Es wurde berichtet, dass die Behandlung mit 2% Ethanol für 24 h eine Gewebe-Ethanol-Konzentration von 80 mM in Zebrafisch-Larven 13 ergab. Andere haben gezeigt, dass Larven diese Konzentration tolerieren und die Leberphänotypen, die in den behandelten Tieren gesehen werden, spezifisch für die Ethanol-Exposition sind 11 , 13 , 15 , 18 . Da jedoch 80 mM bei Menschen 19 nahezu tödlich ist, ist es wichtig, die Leberhistologie des mit Ethanol behandelten Zebrafischs zu bewerten und zu detektierenRmine die physiologische Relevanz für den Menschen.
Die schnelle externe Entwicklung und Transluzenz von Zebrafischlarven ermöglicht es, die Wirkung von Alkohol in der Leber in Echtzeit und in festen Proben zu charakterisieren. Die Verfügbarkeit von zelltypspezifischen fluoreszierenden transgenen Linien und die jüngsten Fortschritte in der konfokalen Mikroskopie erleichtern die Untersuchung, wie verschiedene Leberzelltypen ihre Morphologie und ihr Verhalten in Reaktion auf die akute Ethanolbehandlung 11 , 15 verändern. Allerdings kann die konfokale Bildgebung des fluoreszierenden transgenen Zebrafischs bei der Untersuchung der Leberhistologie nicht vollständig gegen Hämatoxylin und Eosin (H & E) färben. Die Markierung aller Leberzelltypen zur gleichen Zeit mit transgenem Zebrafisch erfordert die Erzeugung von einzelnen transgenen Linien, die jeweils einen Leberzelltyp mit einem einzigartigen Fluorophor markieren. Die Einführung verschiedener transgener Hintergründe in denselben Fisch erfordert BreedinG Mehrfachgenerationen, die zeitaufwändig und teuer ist. Zusätzliche Immunfluoreszenzfärbung ist erforderlich, um extrazelluläre Matrixkomponenten zu detektieren. H & E-Färbung dagegen markiert gleichzeitig alle Leberzelltypen und extrazelluläre Matrixkomponenten und gibt so einen Überblick über die Leber 20 . Darüber hinaus zeigt es leicht einige histopathologische Merkmale von Lebererkrankungen, wie Hepatocyten Tod, Steatose und Fibrose. Obwohl H & E ein routinemäßiger Fleck in der Säugetier-Histologie ist, wird er nicht häufig in der Zebrafisch-Leberforschung verwendet, und das Protokoll ist weniger gut etabliert.
Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll für die akute Ethanolbehandlung in Zebrafischlarven und für die nachfolgenden histologischen Analysen mit H & E-Färbung. Das H & E-Färbeprotokoll kann in allen Studien der Leberentwicklung und -funktion verwendet werden. Darüber hinaus können die Paraffinschnitte für die Immunhistochemie sowie für andere spezielle sta verwendet werdenIns in der Leberpathologie, einschließlich der Trichromfleck, Reticulinfleck usw.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das aktuelle Protokoll beschreibt ein detailliertes Verfahren zur akuten Ethanolbehandlung in Zebrafischlarven und die nachfolgenden histopathologischen Analysen mit H & E-Färbung. Eine akute Ethanolbehandlung sollte nicht früher als 96 h nach der Befruchtung durchgeführt werden, da dies die Stufe ist, in der die Zebrafisch-Leber beginnt, alkohol-metabolisierende Enzyme auszudrücken 13 . 2% Ethanol ist die maximale Dosis, die Larven 13 , <sup class="xref…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten Dr. Katy Murray im Zebrafish International Resource Center anerkennen; Dr. Stacey Huppert und Kari Huppert bei CCHMC, für ihre hilfreiche Beratung zum Protokoll; Und CCHMC Veterinärdienst, für die Fischpflege. Diese Arbeit wurde von NIH Grant R00AA020514 und einem Forschungsstipendium vom Zentrum für pädiatrische Genomik bei CCHMC (nach CY) unterstützt. Es wurde auch teilweise unterstützt von NIH grant P30 DK078392 (Integrative Morphology Core) der Verdauungsstudie Research Core Center in Cincinnati.
Materials
| 1.5 mL centrifuge tubes | E & K Scientific | 280150 | |
| 15 mL conical tubes | VWR International | 89039-664 | |
| 50 mL conical tubes | VWR International | 89039-658 | |
| 95% ethanol | Decon Labs, Inc. | 2801 | Flammable |
| Acetic acid | Newcomer Supply | 10010A | Irritant |
| Agarose | Research Products International | 9012-36-6 | |
| Aluminum jar rack holder | Newcomer Supply | 5300JRK | |
| Bacteriological petri dishes with lid | Corning | 351029 | |
| Biopsy pads | Simport | M476.1 | |
| Charged slides | Fisher Scientific | 12-550-16 | |
| Clear mounting media | Fisher Scientific | 8310-16 | Can be substituted with other clear mounting media |
| Commercial sea salts | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Disposable microtome blades | Fisher Scientific | 4280L | |
| Dissecting microscope | Leica Biosystems | Leica Mz 95 | |
| Enclosed tissue processor | Leica Biosystems | ASP300 S | |
| Eosin-Phloxine stain set | Newcomer Supply | 1082A | |
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich | E7023 | Flammable |
| Formaldehyde solution, ACS reagent, 37 WT. % in H20, contains 10-15% methanol as stabilizer (to prevent polymerization) | Sigma-Aldrich | 252549 | A suspected carcinogen; irritant |
| Formalin, Buffered, 10% | Fisher Scientific | SF100-4 | A suspected carcinogen; irritant |
| Graduated media bottle | VWR International | 16159-520 | |
| Harris hematoxylin | Poly Scientific R&D Corp. | s212 | Irritant |
| Histology molds | Sakura Finetek USA Inc | 4557 | |
| Hot plate/Stirrer | VWR International | 47751-148 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144 | Irritant |
| Incubator | VWR International | 97058-220 | |
| Insulin syringes | BD Medical | BD-309301 | |
| Inverted compound microscope | Carl Zeiss Microscopy | 491912-9850-000 | |
| Isopropanol | Newcomer Supply | 12094E | Flammable |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Irritant |
| Microtome | Leica Biosystems | Leica Jung BioCut 2035 | |
| Nutating mixer | VWR International | 82007-202 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | A suspected carcinogen; irritant |
| Pasteur pipet | VWR International | 53283-916 | |
| Pipette pump (10 mL) | VWR International | 53502-233 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Razor blades | Grainger | 4A807 | |
| Slide Staining Kit | Newcomer Supply | 5300KIT | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher BioReagents | S318-500 | Very hazardous |
| Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| Stainless steel strainer (5 inch diameter) | Adaptive Science Tools | L0906045in | |
| Tissue cassettes | Simport | M505.12 | |
| Tissue embedding center | Sakura Finetek USA Inc | #5100 | |
| Tissue wipers, 1-Ply | Fisher Scientific | 06666A | |
| Transfer pipets | Fisher Scientific | 137117M | |
| Tricaine powder/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma-Aldrich | A5040 | Irritant |
| Tris base, primary standard and buffer | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Wash bottle, low-density polyethylene, wide mouth | Nalge Nunc International | 2402-0750 | |
| Xylenes | Fisher Scientific | X3S-4 | Irritant |
References
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