JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
自动翻译
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
神经科学

Электрофизиологический метод записи цельного клеточного напряжения<em> Drosophila</em> Фоторецепторы

Published: June 13, 2017
doi:
10.3791/55627
, , , ,
1Department of Medical Neurobiology, Faculty of Medicine and the Edmond and Lily Safra Center for Brain Sciences (ELSC),Hebrew University, 2Department of Physiology, Development and Neuroscience,University of Cambridge

Summary

Запись целых клеток из фоторецепторов Drosophila melanogaster позволяет измерять спонтанные темные удары, квантовые удары, макроскопические ответы на свет и отношения напряжения и напряжения при различных условиях. В сочетании с инструментами генетической манипуляции D. melanogaster этот метод позволяет изучать вездесущий сигнальный путь inositol-lipid и его целевой канал TRP.

Abstract

Записи цельного клеточного напряжения от фоторецепторов Drosophila melanogaster произвели революцию в области визуальной трансдукции беспозвоночных, что позволило использовать молекулярную генетику D. melanogaster для изучения каналов передачи inositol-lipid и транзиторного потенциала рецептора (TRP) на уровне одной молекулы. Несколько лабораторий освоили эту мощную технику, которая позволяет анализировать физиологические реакции на свет в условиях высокого контроля. Этот метод позволяет контролировать внутриклеточные и внеклеточные среды; Напряжение мембраны; И быстрое применение фармакологических соединений, таких как различные ионные или рН-индикаторы, к внутри- и внеклеточным средам. С исключительно высоким отношением сигнал / шум этот метод позволяет измерять темные спонтанные и индуцированные светом единичные токи ( то есть спонтанные и квантовые удары) и макроскопические световые токи (LIC) от sinGle D. melanogaster фоторецепторы. В этом протоколе подробно изложены все основные шаги, необходимые для выполнения этого метода, который включает в себя как электрофизиологические, так и оптические записи. Описана процедура вскрытия мухи сетчатки для достижения нетронутой и жизнеспособной изолированной ommatidia ex vivo в ванне. Также подробно описано оборудование, необходимое для проведения измерений цельной и флуоресцентной изображений. Наконец, объясняются подводные камни при использовании этого тонкого препарата во время расширенных экспериментов.

Introduction

Обширные генетические исследования плодовой мушки Drosophila melanogaster ( D. melanogaster) , начатые более 100 лет назад, создали мускул D. melanogaster как чрезвычайно полезную экспериментальную модель для генетической диссекции сложных биологических процессов. Методология, описанная ниже, объединяет накопленную мощность молекулярной генетики D. melanogaster с высоким отношением сигнал / шум для записей цельного клеточного зажима. Эта комбинация позволяет исследовать фототрансдукцию D. melanogaster как модель передачи сигналов инозитол-липидов и регуляции и активации канала TRP как в нативной среде, так и при самом высоком разрешении одиночных молекул.

Применение метода регистрации целых клеток к фоторецепторам D. melanogaster произвело революцию в изучении фототрансдукции беспозвоночных. Этот метод был разработан Hardie 1 и indep2 июня 26 года назад Ранганатхан и его коллеги разработали для использования обширных инструментов генетической манипуляции D. melanogaster и использовали их для выявления механизмов передачи фототрансдукции и инозитол-липидной сигнализации. Сначала этот метод страдал быстрым снижением светочувствительности и низким выходом омматидий во время процесса вскрытия, что предотвращало подробные количественные исследования. Позднее добавление АТФ и НАД к пипетке патча резко увеличило пригодность препарата для длительных количественных записей. После этого была реализована обширная характеристика механизма сигнальной трансдукции на молекулярном уровне.

В настоящее время фототрансдукция D. melanogaster является одной из немногих систем, в которых сигналы фосфоинозитида и TRP-каналы могут быть изучены ex vivo при одномолекулярном разрешении. Это делает фоторедукцию D. melanogaster и меняРазработанная для изучения этого механизма высокочувствительной модельной системы. Этот протокол описывает, как рассекать сетчатку D. melanogaster и механически удалять изолированные омматидии из окружающих клеток пигмента (глии). Это позволяет формировать гига-уплотнение и цельный клеточный патч на телах фоторецепторов. К счастью, большинство сигнальных белков ограничены рабдомером и не распространяются. Кроме того, имеется неподвижный буфер Ca 2+, называемый кальфотин, расположенный между отсеком сигнализации и телом 3 , 4 ячейки, и высокий уровень экспрессии обменника Na + / Ca 2+ (CalX) в микровиллинах 5 . Вместе, ограничение содержания белка в рабдомере, калтотиновом буфере и высокая экспрессия CalX позволяют вести относительно длительную ( т.е. до 20 минут) запись целых клеток без потери основных компонентовПроцесса фототрансдукции и при сохранении высокой чувствительности к свету. Следующий протокол описывает, как получить изолированные омматидии и выполнять записи целых клеток, которые, как представляется, сохраняют нативные свойства фототрансдукционного каскада. Эксперименты с целыми клеточными клещами на диссоциированных тараканах ( Periplaneta americana ) 6 и крикет ( Gryllus bimaculatus ) 7 ommatidia были выполнены аналогично описанным для D. melanogaster . Кроме того, эксперименты по патч-зажимам на диссоциированных фоторецепторах файлового моллюска ( Lima scabra ) и гребешка ( Pecten irradians ) были выполнены несколько иначе, чем эксперименты на D. melanogaster , позволяющие проводить как цельноклеточные 8, так и одноканальные измерения 9 . Здесь описаны основные достижения, полученные в D. melanogaster с использованием этого метода. Обсуждение iNcludes описание некоторых подводных камней и ограничений этой техники.

Protocol

1. Подготовка реагента ПРИМЕЧАНИЕ. Подготовьте все решения в соответствии с инструкциями в таблицах 1-4 . Заполните 10 мл шприц экстрацеллюлярным раствором (ES или ES-0Ca 2+ , как требуется, см. Таблицу 1 ) и держите его на льду. Подготовьте один флакон Растворителя (TS, см. Таблицу 2 , т.е. ES или ES-0Ca 2+ + FBS и сахарозу) и держите его на льду. Подготовьте достаточное количество ES для эксперимента и держите его на льду до тех пор, пока это не понадобится. ПРИМЕЧАНИЕ. Непрерывная перфузия ванны не требуется, поэтому объем ES не должен превышать нескольких десятков мл. Используя фильтр PVDF на 22 мкм, загрузите внутриклеточный раствор (см. Таблицу 3 или таблицу 4 ) в 1 мл шприц с удлиненным наконечником для электрода. Держите это на льду. 2. Общая настройка инструментов для рассечения <p class="Jove_content" fo: keep-together.within-page = "1"> Рисунок 1: Инструменты и устройства, необходимые для приготовления изолированной омматидии. На рисунках показаны различные устройства, необходимые для создания изолированного препарата омматидии, как описано в подробном протоколе выше. Два стакана, один заполненный водой ( А ), а другой заполненный этанолом ( В ) для очистки пипетки ( D ) для растирания, которые соединены с трубкой ( С ). Инструменты для рассечения: 2 пары тонких и 1 пары грубых пинцетов ( F ) и сетчатки ( E ). Для подготовки штифтера сетчатки иглу (рассеивание) микросферирования прессуют между двумя токарными инструментами, действующими в виде тиска ( G ), чтобы сгладить верхнюю часть иглы ( I ). Затем он связан с удлиненным pi ( J ) и смонтирован на держателе иглы ( E ). Бритвенный чип и держатель: Разбейте и установите небольшой треугольный чип бритвенного лезвия с помощью держателя лезвия бритвы ( K ). Рабочая область рассечения состоит из бинокля ( L ) и источника холодного красного света (( M) ) с двумя световодами ( N ). На обеих сторонах бинокля размещены инструменты для рассечения, включая пинцет ( F ), сетчатку ( E ), стаканы ( A и B ), фонарик с красным фильтром ( Q ) и деликатные стеклоочистители ( R ). На столе также помещают ведро для льда с ES, FBS-ES, шприцы внутриклеточного раствора, 60-миллиметровую чашку Петри ( S ) и держатель электрода ( P ). Электроды записи вытягиваются с помощью горизонтального съемника ( T ).E.com/files/ftp_upload/55627/55627fig1large.jpg «target =" _ blank "> Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Постройте сетчатку, чтобы изолировать сетчатку. Вставьте точку (1-4 мм) иглы микроразрушения (энтомологическая игла, длина 12 мм, диаметр 0,1 мм) между двумя тиснительными губками и сгладьте ее, постукивая маленьким молотком. Смонтируйте сплющенную иглу на микрораспакованном держателе иглы (см. Таблицу материалов ). Используя пару пинцета, выровняйте сплющенный конец иглы, чтобы сформировать крючок с кривизной ~ 2,5 мм. Создайте пипетки тритирования для разделения омматидий. Поместите стеклянный капилляр размером 1,2 х 0,68 мм (OD x ID) поверх открытого пламени и отполируйте его, чтобы уменьшить его открытие. Измерьте размер капиллярного отверстия под микроскопом. Сортируйте созданные пипетки омматидиального тритирования в севеN групп по размеру их отверстий ( т.е. 0,2-0,5 мм). Храните их в отдельных подходящих контейнерах ( например, пробирках). Заполните один маленький стакан двойной дистиллированной водой (DDW) и еще один небольшой стакан с этанолом 70%. Накройте каждый стакан листом из парафиновой пленки. Пробейте одно небольшое отверстие в листе из парафиновой пленки, покрывающем стакан DDW (см . Рисунок 1A ). Пробейте семь маленьких отверстий в листе из парафиновой пленки, покрывающих стакан этанола, и пронумеруйте отверстия от 0 до 6 (см . Рисунок 1B ). Поместите одну пипетку омматидиального тритирования из каждой группы размеров в каждом отверстии для парафиновой пленки, так что пипетка с самым большим отверстием расположена в 0 -м отверстии, а пипетка с самым маленьким отверстием расположена в 6 -м отверстии. Подключите пластиковый наконечник пипетки 200 мкл к полиэтиленовой трубке длиной 35 см, 1,57 х 1,14 мм (OD x ID). КонекT другой конец трубки к одной из пипеток омматидиального тритирования с наибольшим отверстием ( т.е. 0,46-0,5 мм), гарантируя, что заостренный конец пипетки растирания не обращен в трубу. Подготовьте пипетки для записи целых клеток, вытащив пипетки патч-зажима из боросиликатной нити размером 1 x 0,58 мм (OD x ID), содержащей стеклянные капилляры. ПРИМЕЧАНИЕ. Сопротивление пипетки должно составлять 8-15 МОм при использовании внутриклеточного раствора на основе глюконата калия (IS1). Можно использовать любой подходящий съемник пипетки (например, см. Таблицу материалов ). Пожарная полировка не требуется. Подготовьте камеру для записи (см . Рисунок 2 ), установив покровное стекло (см. Таблицу материалов ) на дно камеры ванны с использованием расплавленной парафиновой или высоковакуумной силиконовой смазки. Используйте любую подходящую домашнюю или коммерческую камеру, которая обеспечивает доступ к электроду и перфузию, Установите ванну на ступеньку перевернутого микроскопа. Поместите трубку перфузионной системы, систему всасывания и землю ( т . Е. Проволоку / таблетку Ag-AgCl) в ванну (см. Таблицу материалов и рисунок 2 ). Поместите две пары тонких пинцетов № 5 ( рис. 1 ) на рабочую поверхность для использования во время сеанса выделения сетчатки и омматидизации. 3. D. melanogaster Разведение Поднимать D. Melanogaster летает с низкой плотностью населения ( т.е. ~ 20 летит в бутылке объемом 6 унций) в бутылках, содержащих стандартные кукурузные корма при 19-24 ° C. ПРИМЕЧАНИЕ. Предпочтительно работать с темными адаптированными мухами. Чтобы поддерживать высокую чувствительность к свету, уменьшите разнообразие и предотвратите дегенерацию сетчатки у мутантных мух. Задняя часть летает в темноте, по крайней мере, за 24 часа до эксперимента. ПРИМЕЧАНИЕ. Мухи, используемые для экспериментов, должны быть получены(<2 ч) и все еще мягкий, бледный отображающий меконий. ommatidia также может быть легко приготовлена ​​из куколок, хотя их чувствительность к свету затем резко зависит от возраста 10 лет. 4. Рассеяние сетчатки изоляция омматидий: вариант 1 ПРИМЕЧАНИЕ. Выполните следующие шаги под микроскопом стереоскопического масштабирования с использованием амплификации, подходящей для надлежащего просмотра препарата (см . Рис. ). Поместите четыре капли es-0ca 2+ одну каплю ts раствора на 60-миллиметровую чашку Петри, которая была перевернута. Используя грубый пинцет, поймайте вновь закрытую (<2 ч после эклезии) летать своими крыльями или телом. С этого момента выполняйте процедуры быстро тусклым красным освещением при 20 ± ° c. В то время как схватив муху грубыми пинцетом, используйте первую пару тонких пинцетов, чтобы отсоединить головку мухи тела. submerge head в первом капли. Рассекайте голову пополам вдоль сагиттальной плоскости, используя вторую пинцетов. Убедитесь, что конце шага оба глаза остаются неповрежденными. Перенесите половину головы во второй кадр 2+, а – третье снижение тонкие пинцеты, удалите можно больше ткани вокруг глаз убедитесь, сетчатка не наносит вреда. Укрепите край одной роговицы тонким пинцетом выкопайте сетчатку помощью шкипера. По завершении роговица останется пустым неповрежденным, отделенным неповрежденной сетчатки. Промойте пипетку растирания, подключенную насосно-компрессорной колонне, ddw заполните небольшим количеством из четвертой Этот шаг должен выполняться каждый раз, когда используется новая пипетка омматидией ее удалениеМ этанольный стакан (раствор, заполняющий пипетку, соответствовать раствору, котором находится сетчатка). Аккуратно вдыхайте рот, нарисовать изолированную пипетке. Будьте предельно осторожны, взорвать пузырьки воздуха ts. 4.6-4.10 втором глазу. Вытрите деликатных салфеток, оставив только ts, содержащую обе чашке Петри. Добавьте шесть капель верхнюю часть чашки других Замените тритирования пипеткой отверстием меньшего диаметра. его, описано шаге 4.8, качестве заполнения пипетки. Быстро неоднократно аспирируют экспрессируют растворе, начать разделение изолированных омматидий, лишенных пигментных клеток со всей ПРИМЕЧАНИЕ: изолированная омаtidia видны капле по мере того, процесс изоляции прогрессирует, падение становится менее прозрачным. оставшиеся следующее Заполните бывшей каплей (содержащей изолированные омматидии) выпустите ванну. Повторите 4.12-4.14 достижения максимальной изолированной омматидии. Подождите примерно мин, омматидии опустились соприкоснулись нижней частью ванны. перфузионную систему, начните поток 1,5 мМ ca камера полностью заполнена раствором, снизу вверх, земля погружена раствор. Продолжайте мыть ванну 4-5х. 5. Расщепление 2 Примечание. масштабирования, усилительДля правильного Подготовьте чип бритвенного лезвия держатель. Отломите установите небольшой треугольный держателя бритвы ( рис. блюдо >

Representative Results

Описанный метод позволил точную регистрацию основных единичных токов, которые генерируют спонтанные и световые квантовые удары, которые суммируют для получения макроскопического отклика на свет при определенных условиях. Это также позволило сравнить между диким типом и мутантными мухами, которые имеют дефекты в критических сигнальных молекулах ( рис. 3 и 5 ) 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Кроме того, способность измерять потенциал разворота в биионных условиях выявила фундаментальные биофизические свойства каналов TRP и TRP (TRPL) 18 , 19 . Это также позволило измерить влияние аминокислотных замещений в области пор TRP, которые модифицировали его Ca 2+Проницаемость 20 . Светочувствительность, полученная записями цельной ячейки пластыря, линейно зависит от интенсивности света, по меньшей мере, на 4 порядка. Это невозможно было решить, используя методы ERG и внутриклеточной записи. Соответственно, ряд ответов на краткие вспышки возрастающей интенсивности и график функции отклика интенсивности показали строгую линейность вспышки с увеличением интенсивности света. Строгая линейность имеет место, по меньшей мере, несколько сотен pA, но спорно, будет ли после этого нарушаться линейность или контроль зажима ( рис. 6 ). Эти результаты показывают, что макроскопические ответы на свет представляют собой линейное суммирование унитарных ответов на свет ( т. Е. Квантовые удары). Он был хорошо установлен с использованием записей напряжения, которые уменьшают световую стимуляцию indПриводит к дискретным флуктуациям напряжения ( т. Е. К квантовым шишкам) у большинства беспозвоночных. Квантовые удары D. melanogaster являются результатом согласованного открытия ~ 15 каналов TRP и ~ 2 каналов TRPL на пике ударной волны 18 . Каждый удар генерируется поглощением одного фотона, в то время как макроскопический ответ на более интенсивные огни является суммированием этих элементарных ответов 14 , 21 . Шишки значительно различаются в латентности, времени и амплитуде, даже когда условия стимула идентичны. Генерация бум представляет собой стохастический процесс, описываемый статистикой Пуассона, при котором каждый эффективно поглощаемый фотон вызывает только один удар. Для однофотонного единственного отношения требуется, чтобы каждый шаг в каскаде включал не только эффективный механизм «включения», но также и столь же эффективный механизм «выключения». Функциональным преимуществом является производствоОчень чувствительный счетчик фотонов с быстрым переходным откликом, очень хорошо подходящим как для чувствительности, так и для временного разрешения, требуемого визуальной системой. Требование к эффективному механизму выключения проявляется, когда либо активный фотопигмент ( т. Е. Metarhodopsin, M), либо его мишень, G q α, не может инактивироваться и приводит к непрерывному выпуску ударов после выключения света ( рис. 3 ) 15 , 22 , 23 , 24 . Рельеф представляет собой совместную деятельность каналов TRP / TRPL в микровилле. Таким образом, любая гипотеза о активации канала также должна объяснять активацию кооперативного канала. Недавно Харди и его коллеги продемонстрировали, что свет вызывает быстрые сокращения фоторецепторов, что свидетельствует о том, что свет-чувствительностьЕ каналы (TRP / TRPL) могут быть механически закрыты 25 . Эта механическая активация вместе с наблюдаемыми протонами, высвобожденными PLC-опосредованным гидролизом PIP 2, способствует открытию каналов TRP / TRPL и объясняет кооперативную природу выпуклости 26 . В настоящее время фоторецепторы D. melanogaster являются одной из немногих систем, в которых фосфоинозитидные сигнальные каналы и каналы TRP могут быть изучены in vivo , что делает фототрансдукцию D. melanogaster и разработанную методологию, чтобы изучить этот механизм как ценную модельную систему. Рисунок 3: Мутанты inaC P209 и inaD P215 обнаруживают медленное прекращение реакции макроскопического ответа на свет и одиночные квантовые удары. ( A ) Изолированный омматидиум-препаВо время записи цельной клетки представлен рацион с пипеткой с накладками, заполненной флуоресцентным красителем Lucifer Yellow CH (возбуждение: 430 нм, эмиссия: 540 нм). Обратите внимание, что флуоресцентный краситель диффундирует и помечен одним корпусом фоторецепторной клетки и что тела фоторецепторных клеток отсоединены от их удлиненных аксонов, но при этом сохраняют жизнеспособность. Этот препарат подходит для одновременной записи целых ячеек и экспериментов с изображениями. ( BD ) Верхние панели: реакция цельного клеточного квантового ответа на непрерывный тусклый свет (открытый бар) в WT, inaC P209 и inaD P215 мутантных мух. Медленное прекращение ударов наблюдается у inaC P209 и inaD P215 мутантов относительно мух WT. Внизу внизу показана увеличенная форма одиночных ударов. Нижние панели: нормализованные макроскопические ответы с полной ячейкой на световой импульс 500 мкс (1,5 × 10 5 фотонов в секунду) вышеупомянутого дикого типа И мутантные мухи. (EG) Верхние панели: реакция цельного клеточного квантового ответа на сжатие короткого (1 мс), тусклого света, вызывающего однофотонные ответы в дикой природе, arr2 3 и мутанта-мутанта ninaC P235 . Обратите внимание на последовательность ударов, наблюдаемых в мутации arr2 3 и ninaC P235, в ответ на одно поглощение фотонов. Нижние панели: напряжение цельной ячейки зажало нормированные ответы на импульс световой волны 500 мкс (1,5 × 10 4 фотонов / с) в соответствующих мутантах. Обратите внимание на медленное завершение макроскопических ответов, наблюдаемых в arr2 3 И мутант ninaC P235 летит относительно WT. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. D / 55627 / 55627fig4.jpg "/> Рисунок 4: Динамика клеточного Ca 2+ после индуцированного сигналом притока Ca 2+ поражается кальфотином. Временной ряд изображений фоторецепторов дикого типа и Cpn 1% мух, показывающих флуоресценцию индикатора Ca 2+ во время легкой стимуляции. Изображения с интенсивной интенсивностью изображаются с использованием кодирования с ложным цветом (бар = 10 мкм, стрелки указывают пипетку). Рисунок, перепечатанный с разрешения Weiss et al. 4 . Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 5: Электрофизиологические свойства мутантов WT, trp и trpl. ( A ) Зажим цельноклеточного напряжения reco(Квантов) в ответ на непрерывный тусклый свет (открытый бар) в WT, trpl 302 и trp P343 нулевых мутантных мух. Наблюдаются сильно уменьшенные амплитуды trp P34 3 . Вставка: показаны увеличенные одиночные квантовые удары дикого типа и trp P343 муравьиных мух. ( B ) Записи цельного клеточного напряжения в ответ на 3-секундный световой импульс дикого типа и соответствующих мутантов. Наблюдается переходный устойчивый ответ мутанта trp P343 . Вставка: показаны увеличенные световые ответы мутанта WT и trp P343. ( C ) Семейство наложенных световых токов вышеуказанных мух, вызванных в ответ на 20 мс световой импульс, при шагах напряжения 3 мВ, измеренных вокруг потенциала разворота (E rev ). ( D ) Гистограмма, изображающая средний E rev дикого типа и различные мутаныц. Полосами ошибок являются SEM. Потенциал разворота (E rev ) WT находится между положительным E rev trpl 302 , который выражает только TRP, и E rev trp P343 нулевого мутанта, который выражает только TRPL. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 6: Вспышка реагирует строго линейно с увеличением интенсивности света. Ряд текущих ответов на краткие вспышки увеличения интенсивности света и график зависимости амплитуды максимума светового отклика от возрастающей интенсивности кратковременных световых вспышек. Это соотношение показывает строгую линейность между вспышкой и увеличением интенсивности света. Эта строгая линейностьСоставляет не менее нескольких сотен pA, причем интенсивность света составляет более 4 порядков, в то время как спорно, является ли это линейность или контроль зажима, который затем разрушается. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. pH 7.15 (регулировать с помощью NaOH) реактив Концентрация (мМ) NaCl 120 KCl 5 MgCl 2 4 TES 10 Proline 25 аланин 5 Хранить при -20 ° C. <td colspan= "«2»"> Примечание. Этот раствор номинально Ca 2+ свободный, но не содержит добавок Ca 2+ и, следовательно, будет иметь примерно 5-10 мкМ следа Ca 2+ . Внеклеточный раствор (ES) = ES-0Ca 2+ с 1,5 мМ CaCl 2 , полученный добавлением CaCl 2 из исходного раствора 0,5 или 1 М в ES-0Ca 2+ . Таблица 1: Внеклеточное решение без Ca + 2 (ES). Химическое описание и удельные количества, необходимые для получения Ca + 2- свободных ES. реактив Количество FBS 15 мл сахароза 1,5 г Разделить на 150 мкл аликвоты в пробирках объемом 1,5 мл и хранить при -20 76 ° С. Раствор для растирания (TS) Заполните 1 флакон 150 мл исходного раствора 1,350 мл ES или ES-0Ca 2+ в соответствии с раствором, используемым во время вскрытия. Таблица 2: Фетальная бычья сыворотка (FBS) + Сахароза – раствор. Химическое описание и удельные количества, необходимые для получения фетальной бычьей сыворотки (FBS) + сахарозы – исходного раствора. pH 7.15 (настроить с помощью KOH) реактив Концентрация (мМ) Глюконат калия (Kglu) 140 MgCl 2 2 TES 10 Магний соль АТФ (MgATP) 4 Натриевую соль ГТФ (Na 2 ГТФ) 0,4 Β-никотинамидадениндинуклеотидгидрат (NAD) 1 Хранить при -20 ° C. Таблица 3: Внутриклеточное решение (IS1). Химическое описание и удельные количества, необходимые для получения IS1, который в основном используется для измерения интенсивности и квантовых измерений. pH 7.15 (регулировать с помощью CsOH) реактив Концентрация (мМ) CsCl 120 MgCl 2 2 TES 10 Магний соль АТФ (MgATP) 4 Натриевую соль ГТФ (Na 2 ГТФ) 0,4 Β-никотинамидадениндинуклеотидгидрат (NAD) 1 Тетра-этил-аммонийхлорид (TAE) 15 Хранить при -20 ° C. Таблица 4: Внутриклеточное решение (IS2). Химическое описание и удельные количества, необходимые для получения внутриклеточного раствора IS2, который в основном используется для измерения потенциала потенциального света, вызванного светом.

Discussion

Применение записи целых клеток к фоторецепторам D. melanogaster позволило обнаружить и функциональное выяснение новых сигнальных белков, таких как каналы TRP 27 , 28 , 29 и INAD 30 , 31 , 32 . С тех пор, как началось внедрение этого метода, оно позволило разрешить долгосрочные основные вопросы, касающиеся ионного механизма и зависимости светового отклика от напряжения. Это произошло из-за предоставленной способности точно контролировать напряжение мембраны и внеклеточный и внутриклеточный ионный состав 19 , 28 .

Основным препятствием для метода зажима патча в D. melanogaster была хрупкость изолированной формы омматидиирацион. Подробные исследования показали, что целостность оборудования фототрансдукции критически зависит от непрерывного питания АТФ, особенно при освещении, что приводит к большому расходу АТФ. К сожалению, механическая чередование клеток пигмента ( т.е. глии), которые необходимы для достижения мембраны фоторецептора с помощью пипетки патча, устраняет основной источник метаболитов, необходимых для производства АТФ 33 . Применение экзогенного АТФ в записывающей пипетке лишь частично удовлетворяет требованиям к большим количествам АТФ. Короткая подача АТФ приводит к спонтанной активации каналов ГТО и к диссоциации фототрансдукционного аппарата из активированных светом каналов, что вызывает значительное увеличение клеточного Ca 2+ и отмену нормального ответа на свет 34 , 35 . Эта последовательность событий не связана с повреждениемФоторецепторов по процедуре вскрытия, а скорее к клеточному истощению АТФ. Чтобы предотвратить появление этой последовательности событий и поддержание нормальных световых ответов, фоторецепторы не должны подвергаться воздействию интенсивных огней, которые потребляют большое количество АТФ. Кроме того, NAD должен быть включен в пипетку записи, по-видимому, для облегчения производства АТФ в митохондриях 18 , 36 . Для измерений спонтанных и квантовых ударов вышеуказанная трудность минимальна, поскольку используются только тусклые огни. На практике стабильная запись в цельной ячейке может поддерживаться на протяжении ~ 20-25 мин, хотя в течение этого периода наблюдается тенденция к замедлению кинетики ответа. Один препарат диссоциированных омматидий может оставаться жизнеспособным в течение 2 часов.

Дополнительным недостатком изолированного препарата ommatidia является недоступность микроворсинок, что приводит к недоступности ГТО иTRPL в пипетку записи, предотвращая одноканальные записи. Используя разработанный им метод, Bacigalupo и его коллегам удалось непосредственно записать одноканальную активность из рабдомера 37 . Однако активность этого канала отличается от активности каналов TRPL, гетерологично экспрессируемых в клетках 38 культуры ткани, и активности канала TRP, полученной из анализа дробового шума, полученного из изолированных омматидий 34 . Предположительно, процедура вскрытия сильно испортила фоторецепторные клетки при использовании этого метода.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Экспериментальная часть этого исследования была поддержана грантами Национального научного фонда США-Израиля Bi (BM и IL), Научного фонда Израиля (ISF), Deutsch-Israelische Projektkooperation (DIP) (до BM) и Биотехнологии И Исследовательский совет по биологическим наукам (BBSRC Грантовые номера: BB / M007006 / 1 и BB / D007585 / 1) до RCH

Materials

10 ml syringe
5 ml syringe
1 ml syringe with elongated tip
Petri dish 60 mm
Silicone dissection dish/block Dow Corning Sylguard 184 Silicone Elastomer Kit Throughly mix both components, pour into mould and cure for 2 hours at 60ᵒC
Syringe filters Millex 22 µm PVDF filter 
Capillaries (for omatidia separation) Glass, 1.2 x 0.68 mm (~7.5 cm each)
Polyethylene Tubing Becton Dickinson 1.57 x 1.14 mm (35 cm)
 2 small beakers 50 ml or less
2 paraffin film sheets Parafilm M ~5 x 5 cm
Bath chamber home made
Cover slips 22 x 22 mm No. 0
Paraplast Plus Sigma Paraffin – polyisobutylene mixture To glue the coverslip onto the bottom of the bath chamber
Ground Warner Instruments  64-1288 Hybrid Assembly Ag-AgCl Wire Assembly
Headless micro dissection needle Entomology, 12 mm
Micro dissecting needle holder
Vise
2 fine tweezers + 1 rough tweezers Dumont #5, Biology  0.05 x 0.02 mm, length 110 mm, Inox
Stereoscopic zoom Microscope  Nikon SMZ-2B
Cold light source Schott KL1500 LCD
Filter (Color) for cold light source Schott RG620
Delicate wipers Kimtech Kimwipes
Electrode holder Warner Instruments QSW-T10P Q series Holders compatible with Axon amplifiers, straight body style
Silver Wire Warner Instruments 0.25 mm diameter, needs to be chloridized
Micromanipulator Sutter Instruments MP 85 Huxley-Wall Style Micromanipulator
Faraday cage home made Electromagnetic noise shielding and black front curtain
Anti-vibration Table Newport VW-3036-OPT-01
Osilloscope GW GOS-622G
Perfusion system Warner Instruments VC-8P Pinch valve control system
Perfusion valve controller Scientific instruments BPS-8
Suction system
Amplifier Molecular Device Axopatch-1D
Head-stage Molecular Device CV – 4 Gain: x 1/100
A/D converter Molecular Device Digidata 1440A
Clampex Molecular Device 10 software
pCLAMP Molecular Device 10 software
Light source (Xenon Arc lamp) Sutter Instruments Lambda LS
Light detector home made phototransistor
Filter wheel and shutter controller Sutter Instruments Lambda 10-2 with a Uniblitz shutter
Filters (Natural density filter) Chroma 6,5,4,3,2,1,0.5,0.3
Filter (Color) Schott OG590, Edge filter
Xenon Flash Lamp system Dr. Rapp OptoElecftronic JML-C2
Light guide Quartz 
Pulse generator AMPI Master 8
Microscope Olympus IX71, Inverted
Red illumination filter (Microscope) RG630 / RG645 ø45mm
Microscope objective Olympus X60/0.9 UplanFL N air or X60/1.25 UplanFI oil
CCD Camera Andor iXon DU885K
NIS Element  Nikon AR software
Ca+2 indicator Invitrogen Calcium green 5N
Excitation & emission filters and dichroic mirror Chroma 19002 – AT – GFP/FITC Longpass set
Vertical pipette puller Narishige  Model PP83 Use either vertical or horizontal puller, as preferred.
Horizontal pipette puller Sutter Instrument  Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette Puller
Filament Sutter Instrument 3 mm trough or square box
Capillaries Harvard Apparatus borosilicate glass capillaries 1 x 0.58 mm
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hardie, R. C. Whole-cell recordings of the light induced current in dissociated Drosophila photoreceptors: evidence for feedback by calcium permeating the light-sensitive channels. Proc. R. Soc. Lond. B. 245, 203-210 (1991).
  2. Ranganathan, R., Harris, G. L., Stevens, C. F., Zuker, C. S. A Drosophila mutant defective in extracellular calcium- dependent photoreceptor deactivation and rapid desensitization. Nature. 354, 230-232 (1991).
  3. Martin, J. H., Benzer, S., Rudnicka, M., Miller, C. A. Calphotin: a Drosophila photoreceptor cell calcium-binding protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (4), 1531-1535 (1993).
  4. Weiss, S., et al. Compartmentalization and Ca2+ buffering are essential for prevention of light-induced retinal degeneration. J Neurosci. 32 (42), 14696-14708 (2012).
  5. Wang, T., et al. Light activation, adaptation, and cell survival functions of the Na + /Ca 2+ exchanger CalX. Neuron. 45 (3), 367-378 (2005).
  6. Weckstrom, M., Hardie, R. C., Laughlin, S. B. Voltage-activated potassium channels in blowfly photoreceptors and their role in light adaptation. J. Physiol. Lond. 440, (1991).
  7. Frolov, R. V., Immonen, E. V., Weckström, M. Performance of blue- and green-sensitive photoreceptors of the cricket Gryllus bimaculatus. J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 200 (3), 209-219 (2014).
  8. Nasi, E. Whole-cell clamp of dissociated photoreceptors from the eye of Lima scabra. J Gen Physiol. 97 (1), 35-54 (1991).
  9. Nasi, E., Gomez, M. P. Light-activated ion channels in solitary photoreceptors of the scallop Pecten irradians. J. Gen. Physiol. 99, 747-769 (1992).
  10. Hardie, R. C., Peretz, A., Pollock, J. A., Minke, B. Ca 2+ limits the development of the light response in Drosophila photoreceptors. Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 252, 223-229 (1993).
  11. Kohn, E., et al. Functional Cooperation between the IP3 Receptor and Phospholipase C Secures the High Sensitivity to Light of Drosophila Photoreceptors In Vivo. J Neurosci. 35 (6), 2530-2546 (2015).
  12. Hevers, W., Hardie, R. C. Serotonin modulates the voltage dependence of delayed rectifier and Shaker potassium channels in Drosophila photoreceptors. Neuron. 14 (4), 845-856 (1995).
  13. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  14. Henderson, S. R., Reuss, H., Hardie, R. C. Single photon responses in Drosophila photoreceptors and their regulation by Ca 2. J. Physiol. Lond. 524 (Pt 1), 179-194 (2000).
  15. Scott, K., Zuker, C. S. Assembly of the Drosophila phototransduction cascade into a signalling complex shapes elementary responses. Nature. 395 (6704), 805-808 (1998).
  16. Elia, N., Frechter, S., Gedi, Y., Minke, B., Selinger, Z. Excess of G betae over G qalphae in vivo prevents dark, spontaneous activity of Drosophila photoreceptors. J. Cell Biol. 171 (3), 517-526 (2005).
  17. Katz, B., Minke, B. Phospholipase C-Mediated Suppression of Dark Noise Enables Single-Photon Detection in Drosophila Photoreceptors. J. Neurosci. 32 (8), 2722-2733 (2012).
  18. Hardie, R. C., et al. Molecular basis of amplification in Drosophila phototransduction. Roles for G protein, phospholipase C, and diacylglycerol kinase. Neuron. 36 (4), 689-701 (2002).
  19. Reuss, H., Mojet, M. H., Chyb, S., Hardie, R. C. In vivo analysis of the Drosophila light-sensitive channels, TRP and TRPL. Neuron. 19, 1249-1259 (1997).
  20. Liu, C. H., et al. In vivo identification and manipulation of the Ca 2+ selectivity filter in the Drosophila transient receptor potential channel. J. Neurosci. 27 (3), 604-615 (2007).
  21. Ahmad, S. T., Natochin, M., Barren, B., Artemyev, N. O., O’Tousa, J. E. Heterologous expression of bovine rhodopsin in Drosophila photoreceptor cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (9), 3722-3728 (2006).
  22. Scott, K., Sun, Y., Beckingham, K., Zuker, C. S. Calmodulin regulation of Drosophila light-activated channels and receptor function mediates termination of the light response in vivo. Cell. 91 (3), 375-383 (1997).
  23. Liu, C. H., et al. Ca 2+ -dependent metarhodopsin inactivation mediated by calmodulin and NINAC myosin III. Neuron. 59 (5), 778-789 (2008).
  24. Cook, B., et al. Phospholipase C and termination of G-protein-mediated signalling in vivo. Nat. Cell Biol. 2 (5), 296-301 (2000).
  25. Hardie, R. C., Franze, K. Photomechanical responses in Drosophila photoreceptors. Science. 338 (6104), 260-263 (2012).
  26. Huang, J., et al. Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors. Curr. Biol. 20 (3), 189-197 (2010).
  27. Minke, B., Wu, C. F., Pak, W. L. Isolation of light-induce response of the central retinular cells from the electroretinogram of Drosophila. J. Comp. Physiol. 98, 345-355 (1975).
  28. Hardie, R. C., Minke, B. The trp gene is essential for a light-activated Ca2+ channel in Drosophila photoreceptors. Neuron. 8, 643-651 (1992).
  29. Niemeyer, B. A., Suzuki, E., Scott, K., Jalink, K., Zuker, C. S. The Drosophila light-activated conductance is composed of the two channels TRP and TRPL. Cell. 85 (5), 651-659 (1996).
  30. Huber, A., et al. The transient receptor potential protein (Trp), a putative store- operated Ca 2+ channel essential for phosphoinositide-mediated photoreception, forms a signaling complex with NorpA, InaC and InaD. EMBO J. 15 (24), 7036-7045 (1996).
  31. Shieh, B. H., Niemeyer, B. A novel protein encoded by the InaD gene regulates recovery of visual transduction in Drosophila. Neuron. 14 (1), 201-210 (1995).
  32. Tsunoda, S., et al. A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade. Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).
  33. Tsacopoulos, M., Veuthey, A. L., Saravelos, S. G., Perrottet, P., Tsoupras, G. Glial cells transform glucose to alanine, which fuels the neurons in the honeybee retina. J. Neurosci. 14 (3 Pt 1), 1339-1351 (1994).
  34. Hardie, R. C., Minke, B. Spontaneous activation of light-sensitive channels in Drosophila photoreceptors. J. Gen. Physiol. 103, 389-407 (1994).
  35. Agam, K., et al. Metabolic stress reversibly activates the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL in vivo. J Neurosci. 20 (15), 5748-5755 (2000).
  36. Agam, K., Frechter, S., Minke, B. Activation of the Drosophila TRP and TRPL channels requires both Ca2+ and protein dephosphorylation. Cell Calcium. 35 (2), 87-105 (2004).
  37. Delgado, R., Muñoz, Y., Peña-Cortés, H., Giavalisco, P., Bacigalupo, J. Diacylglycerol activates the light-dependent channel TRP in the photosensitive microvilli of Drosophila melanogaster photoreceptors. J Neurosci. 34 (19), 6679-6686 (2014).
  38. Parnas, M., Katz, B., Minke, B. Open channel block by Ca2+ underlies the voltage dependence of Drosophila TRPL channel. J. Gen. Physiol. 129 (1), 17-28 (2007).

Tags

Keywords: ElectrophysiologyWhole-cell Voltage ClampDrosophilaPhotoreceptorsPhototransductionTRP ChannelsVisual TransductionDissectionCalcium-free Extracellular SolutionInverted MicroscopePerfusion SystemSuction SystemGround WireElectrophysiology Setup
check_url/cn/55627?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Katz, B., Gutorov, R., Rhodes-Mordov, E., Hardie, R. C., Minke, B. Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors. J. Vis. Exp. (124), e55627, doi:10.3791/55627 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image