从黑腹果蝇光感受器的全细胞记录使得能够测量自发的黑色凸起,量子隆起,对光的宏观反应以及在各种条件下的电流 – 电压关系。与黑腹果蝇遗传操作工具结合使用,该方法能够研究普遍存在的肌醇脂质信号通路及其靶标TRP通道。
从黑腹果蝇光感受器的全细胞电压钳记录已经彻底改变了无脊椎动物视觉转导的领域,使得能够使用黑腹果蝇分子遗传学在单分子水平上研究肌醇 – 脂质信号传导和瞬时受体电位(TRP)通道。一些实验室掌握了这种强大的技术,可以在高度受控条件下分析对光的生理反应。这种技术允许控制细胞内和细胞外介质;膜电压;以及药物化合物如各种离子或pH指示剂快速应用于细胞外和细胞外培养基。具有非常高的信噪比,该方法能够测量暗自发和光诱导的单一电流( 即自发和量子隆起)和宏观光诱导电流(LIC)从single D. melanogaster光感受器。该协议非常详细地概述了执行此技术所需的所有关键步骤,包括电生理和光学记录。描述了在浴室中获得完整和可行的离体体外分离的眼药水的蝇眼视网膜解剖程序。还需要进行全细胞和荧光成像测量所需的设备。最后,解释了在扩展实验期间使用这种精致准备的陷阱。
果蝇的深入遗传研究,果蝇黑腹果蝇( D. melanogaster) ,在100多年前开始,已经建立了黑腹果蝇,作为复杂生物过程的遗传解剖非常有用的实验模型。下面描述的方法将黑腹果蝇分子遗传学的积累能力与全细胞膜片钳记录的高信噪比相结合。这种组合允许研究黑腹果蝇光转移作为肌醇 – 脂质信号和TRP通道调节和活化的模型,无论是在天然环境中还是在单分子的最高分辨率下。
全细胞记录方法对黑腹果蝇光感受器的应用已经彻底改变了无脊椎动物光转导的研究。这种方法是由Hardie 1和Indep开发的由Ranganathan及其同事2 〜26年前提出,旨在利用黑腹果蝇广泛的遗传操作工具,利用它们发现光转导和肌醇 – 脂质信号传导机制。首先,这种技术在解剖过程中光敏感性快速降低,恶心病的产量低,这阻碍了详细的定量研究。之后,将ATP和NAD添加到贴片移液器中,显着提高了长时间定量记录制剂的适用性。此后,实现了分子水平信号转导机制的广泛表征。
目前, 黑腹果蝇光转移是在单分子分辨率下离体研究磷酸肌醇信号和TRP通道的少数系统之一。这使得黑腹果蝇的光转导和我研究这种机制的方法学是一个高度敏感的模型系统。该方案描述了如何解剖黑腹果蝇视网膜并机械剥离孤立的ommatidia与周围的颜料(胶质细胞)细胞。这使得能够在感光体细胞体上形成千兆密封和全细胞膜片钳。幸运的是,大多数信号蛋白被限制在横纹肌上,不扩散。此外,还有一种称为钙调蛋白的固定Ca 2+缓冲液,位于信号传导室和细胞体3,4之间,在微绒毛5中有一个高表达量的Na + / Ca 2+交换体(CalX)。在一起,对横纹肌,钙镁缓冲液的蛋白质限制和CalX的高表达允许相对延长( 即高达〜20分钟)全细胞记录,而不损失必需组分的光转换过程,同时保持对光的高灵敏度。以下协议描述了如何获得孤立的ommatidia并执行看起来保持光转录级联的天然特性的全细胞记录。对于分离的蟑螂( 美洲大蠊 ) 6和板球( Gryllus bimaculatus ) 7的 o虫进行全细胞膜片钳实验,与对黑腹果蝇类似地进行。此外,以与黑腹果蝇进行的方式稍微不同的方式进行文件蛤( Lima scabra )和扇贝( Pecten radians )的离解光感受器的膜片钳实验 ,允许全细胞8和单通道测量9 。在这里,描述了使用这种技术在黑腹果蝇获得的主要成就。讨论我包括对这种技术的一些陷阱和限制的描述。
将全细胞记录应用于黑腹果蝇光感受器允许新型信号蛋白如TRP通道27,28,29和INAD 30,31,32框架蛋白的发现和功能性阐明。自从这种技术的初步介绍以来,它能够解决关于光响应的离子机制和电压依赖性的长期基本问题。这是因为赋予了精确控制膜电压和胞外和细胞内离子组合物19,28的能力。
黑腹果蝇斑块夹紧技术的主要障碍是孤立的ommatidia prepa的脆弱性配给。详细研究表明,光转导机制的完整性主要取决于ATP的连续供应,特别是在光照下,导致ATP消耗量大。不幸的是,用贴片移液管到达感光膜所需的颜料( 即胶质细胞)的机械条纹消除了ATP生产所需的主要代谢源33 。外源ATP在记录移液器中的应用仅部分满足大量ATP的需求。短暂的ATP供应导致TRP通道的自发激活和光激活通道的光转导机制的解离,导致细胞Ca 2+的大量增加和废除对光的正常反应34,35 。这个事件的顺序不是由于损坏的光感受器通过解剖程序,而是ATP的细胞衰竭。为了防止发生这种事件序列并保持正常的光反应,光感受器不应该暴露于消耗大量ATP的强光下。此外,NAD必须包括在记录移液器中,大概是为了促进线粒体中的ATP生成18,36。对于自发和量子碰撞的测量,上述困难是最小的,因为只使用昏暗的灯。实际上,稳定的全细胞记录可以保持约20-25分钟,尽管在这一时期内有反应动力学减慢的倾向。单一的解离的恶臭药物的制备可以保持存活长达2小时。
孤立的ommatidia制剂的另一个缺点是微绒毛的不可接近性,这转化为TRP的不可接近性,TRPL通道到记录移液器,防止单声道录音。 Bacigalupo和他的同事使用他们开发的方法,成功地直接记录了横纹肌的单通道活动。然而,该通道活性不同于在组织培养细胞38中异源表达的TRPL通道的通道活性和来自从孤立的ommatidia 34获得的喷射噪声分析的TRP通道活性。推测使用这种方法时,解剖程序会大大损伤感光细胞。
The authors have nothing to disclose.
这项研究的实验部分得到美国以色列双国科学基金会(BM和IL),以色列科学基金会(ISF),德语以色列项目(DIP)(BM)和生物技术和生物科学研究委员会(BBSRC授权号:BB / M007006 / 1和BB / D007585 / 1)
10 ml syringe | |||
5 ml syringe | |||
1 ml syringe with elongated tip | |||
Petri dish | 60 mm | ||
Silicone dissection dish/block | Dow Corning | Sylguard 184 Silicone Elastomer Kit | Throughly mix both components, pour into mould and cure for 2 hours at 60ᵒC |
Syringe filters | Millex | 22 µm PVDF filter | |
Capillaries (for omatidia separation) | Glass, 1.2 x 0.68 mm (~7.5 cm each) | ||
Polyethylene Tubing | Becton Dickinson | 1.57 x 1.14 mm (35 cm) | |
2 small beakers | 50 ml or less | ||
2 paraffin film sheets | Parafilm M | ~5 x 5 cm | |
Bath chamber | home made | ||
Cover slips | 22 x 22 mm No. 0 | ||
Paraplast Plus | Sigma | Paraffin – polyisobutylene mixture | To glue the coverslip onto the bottom of the bath chamber |
Ground | Warner Instruments | 64-1288 | Hybrid Assembly Ag-AgCl Wire Assembly |
Headless micro dissection needle | Entomology, 12 mm | ||
Micro dissecting needle holder | |||
Vise | |||
2 fine tweezers + 1 rough tweezers | Dumont #5, Biology | 0.05 x 0.02 mm, length 110 mm, Inox | |
Stereoscopic zoom Microscope | Nikon | SMZ-2B | |
Cold light source | Schott | KL1500 LCD | |
Filter (Color) for cold light source | Schott | RG620 | |
Delicate wipers | Kimtech | Kimwipes | |
Electrode holder | Warner Instruments | QSW-T10P | Q series Holders compatible with Axon amplifiers, straight body style |
Silver Wire | Warner Instruments | 0.25 mm diameter, needs to be chloridized | |
Micromanipulator | Sutter Instruments | MP 85 | Huxley-Wall Style Micromanipulator |
Faraday cage | home made | Electromagnetic noise shielding and black front curtain | |
Anti-vibration Table | Newport | VW-3036-OPT-01 | |
Osilloscope | GW | GOS-622G | |
Perfusion system | Warner Instruments | VC-8P | Pinch valve control system |
Perfusion valve controller | Scientific instruments | BPS-8 | |
Suction system | |||
Amplifier | Molecular Device | Axopatch-1D | |
Head-stage | Molecular Device | CV – 4 | Gain: x 1/100 |
A/D converter | Molecular Device | Digidata 1440A | |
Clampex | Molecular Device | 10 | software |
pCLAMP | Molecular Device | 10 | software |
Light source (Xenon Arc lamp) | Sutter Instruments | Lambda LS | |
Light detector | home made | phototransistor | |
Filter wheel and shutter controller | Sutter Instruments | Lambda 10-2 with a Uniblitz shutter | |
Filters (Natural density filter) | Chroma | 6,5,4,3,2,1,0.5,0.3 | |
Filter (Color) | Schott | OG590, Edge filter | |
Xenon Flash Lamp system | Dr. Rapp OptoElecftronic | JML-C2 | |
Light guide | Quartz | ||
Pulse generator | AMPI | Master 8 | |
Microscope | Olympus | IX71, Inverted | |
Red illumination filter (Microscope) | RG630 / RG645 ø45mm | ||
Microscope objective | Olympus | X60/0.9 UplanFL N air or X60/1.25 UplanFI oil | |
CCD Camera | Andor | iXon DU885K | |
NIS Element | Nikon | AR | software |
Ca+2 indicator | Invitrogen | Calcium green 5N | |
Excitation & emission filters and dichroic mirror | Chroma | 19002 – AT – GFP/FITC Longpass set | |
Vertical pipette puller | Narishige | Model PP83 | Use either vertical or horizontal puller, as preferred. |
Horizontal pipette puller | Sutter Instrument | Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette Puller | |
Filament | Sutter Instrument | 3 mm trough or square box | |
Capillaries | Harvard Apparatus | borosilicate glass capillaries | 1 x 0.58 mm |