JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
自动翻译
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
神经科学

Elektrofysiologische methode voor opname van volledige spanningsklemmen van<em> Drosophila</em> Photoreceptors

Published: June 13, 2017
doi:
10.3791/55627
, , , ,
1Department of Medical Neurobiology, Faculty of Medicine and the Edmond and Lily Safra Center for Brain Sciences (ELSC),Hebrew University, 2Department of Physiology, Development and Neuroscience,University of Cambridge

Summary

Whole-cell opnames van Drosophila melanogaster fotoreceptoren maken het mogelijk om spontaan donkere stoten, kwantumstoten, macroscopische reacties op licht en spanningsrelaties onder verschillende omstandigheden te meten. In combinatie met D. melanogaster genetische manipulatie instrumenten, deze methode maakt het mogelijk om de alomtegenwoordige inositol-lipide signalering weg en zijn doel, het TRP kanaal te onderzoeken.

Abstract

Whole-cell voltage voltage opnames van Drosophila melanogaster photoreceptors hebben het gebied van de invertebrate visuele transductie, waardoor het gebruik van D. melanogaster moleculaire genetica inositol-lipid signalering en transient receptor receptor potentiële (TRP) kanalen op het single-molecuul niveau kunnen onderzoeken. Een handvol labs hebben deze krachtige techniek beheerd, waardoor de fysiologische responsen op licht onder zeer gecontroleerde omstandigheden kunnen worden geanalyseerd. Deze techniek zorgt voor controle over de intracellulaire en extracellulaire media; De membraanspanning; En de snelle toepassing van farmacologische verbindingen, zoals een verscheidenheid aan ionische of pH-indicatoren, op de intra- en extracellulaire media. Met een uitzonderlijk hoge signaal-ruisverhouding kan deze methode de meting van donkere spontane en licht geïnduceerde eenheidstromen ( dwz spontane en kwantumstoten) en macroscopische licht-geïnduceerde stromingen (LIC) van de zondeGle D. melanogaster fotoreceptoren. Dit protocol schetst in groot detail alle belangrijke stappen die nodig zijn om deze techniek uit te voeren, die zowel elektrofysiologische als optische opnamen omvat. De procedure voor de retina dissectie voor het bereiken van intacte en levensvatbare ex vivo geïsoleerde ommatidia in de badkamer wordt beschreven. De apparatuur die nodig is voor het uitvoeren van full-cell en fluorescentie beeldvorming metingen zijn ook gedetailleerd. Tenslotte worden de valkuilen in het gebruik van deze delicate voorbereiding tijdens uitgebreide experimenten toegelicht.

Introduction

Uitgebreide genetische studies van de vruchtvlieg , Drosophila melanogaster ( D. melanogaster) , die meer dan 100 jaar geleden zijn ingezet, hebben de D. melanogastervliegtuig opgezet als een extreem nuttig experimenteel model voor de genetische dissectie van complexe biologische processen. De hierna beschreven methodologie combineert de geaccumuleerde kracht van de D. melanogaster moleculaire genetica met de hoge signaal- ruisverhouding van volledige-cel patch klemopnamen. Deze combinatie zorgt voor de studie van D. melanogaster phototransduction als een model van inositol-lipid signalering en TRP kanaal regulatie en activatie, zowel in de native omgeving als bij de hoogste resolutie van enkele moleculen.

Toepassing van de hele cel opname methode op D. melanogaster photoreceptors heeft de studie van invertebrate phototransduction omgezet. Deze methode is ontwikkeld door Hardie 1 en indepEindelijk door Ranganathan en collega's 2 ~ 26 jaar geleden en was ontworpen om de uitgebreide genetische manipulatie-instrumenten van D. melanogaster te exploiteren en ze te gebruiken om mechanismen van fototransductie en inositol-lipide signalering te ontdekken. In de eerste plaats leed deze techniek aan een snelle vermindering van de lichtgevoeligheid en een lage opbrengst van ommatidia tijdens het dissectieproces, waardoor gedetailleerde kwantitatieve studies werden voorkomen. Later verhoogde de toevoeging van ATP en NAD aan de patchpipet de geschiktheid van het preparaat voor langdurige kwantitatieve opnames. Vervolgens werd uitgebreide karakterisering van het signaal-transductiemchanisme op het moleculaire niveau gerealiseerd.

Momenteel is D. melanogaster phototransduction één van de weinige systemen waarin fosfoinositide-signalering en TRP kanalen ex vivo kunnen worden bestudeerd bij een molecuulresolutie. Dit maakt D. melanogaster phototransduction en de mijThodology ontwikkeld om dit mechanisme een zeer gevoelig modelsysteem te bestuderen. Dit protocol beschrijft hoe het D. melanogaster retina dissecteert en de geïsoleerde ommatidia van de omliggende pigment (glia) cellen mechanisch afbreken. Dit stelt de vorming van een giga-seal en een hele-cel patch klem op de photoreceptor cel lichamen mogelijk. Gelukkig zijn de meeste signaalproteïnen beperkt tot de rhabdomere en diffunderen ze niet. Bovendien is er een immobiele Ca 2+ buffer genaamd calphotin, gelegen tussen het signaalcompartiment en het cellichaam 3 , 4 en een hoog expressieniveau van de Na + / Ca 2+ wisselaar (CalX) in de microvilli 5 . Samen vormen de eiwitbevestiging aan de rhabdomere, de calphotinbuffer en de hoge expressie van de CalX relatief langdurige ( dwz maximaal ~ 20 minuten) volledige celopnamen zonder verlies van essentiële componentenVan het fototransductieproces en met behoud van hoge gevoeligheid voor licht. Het volgende protocol beschrijft hoe u geïsoleerde ommatidia kunt verkrijgen en volledige cilinderopnamen uitvoeren die de inheemse eigenschappen van de fototransductiekascade voorkomen. Hele-cel patch klem experimenten op gedissocieerde kakkerlak ( Periplaneta americana ) 6 en cricket ( Gryllus bimaculatus ) 7 ommatidia werden op dezelfde wijze uitgevoerd als die beschreven voor D. melanogaster . Daarnaast werden patchclamp-experimenten op gedissocieerde fotoreceptoren van het bestandsbloem, ( Lima scabra ) en sint- jakobsschelp ( Pecten-irradians ) op een enigszins andere manier uitgevoerd dan die uitgevoerd op D. melanogaster , waardoor zowel de hele cel 8 als een kanaalsmeting 9 . Hier worden de belangrijkste prestaties verkregen in D. melanogaster met behulp van deze techniek beschreven. De discussie iBevat de beschrijving van sommige valkuilen en beperkingen van deze techniek.

Protocol

1. Reagensbereiding OPMERKING: Bereid alle oplossingen volgens de instructies in Tabel 1-4 aan . Vul een 10 ml spuit met extracellulaire oplossing (ES of ES-0Ca 2+ , indien nodig, zie tabel 1 ) en houd het op ijs. Maak een injectieflacon van Trituration Solution (TS, zie tabel 2 , dat wil zeggen ES of ES-0Ca 2+ + FBS en sucrose) en houd dit op ijs. Bereid voldoende ES voor het experiment en houd dit op ijs totdat het nodig is. OPMERKING: Doorlopende bad perfusie is niet nodig, dus het volume van ES hoeft niet meer dan een paar dozijn ml te zijn. Met behulp van een 22 μm PVDF filter, laad de intracellulaire oplossing (zie tabel 3 of tabel 4 ) in een 1 ml spuit met een elektrode vulling langwerpige tip. Hou dit op ijs. 2. Algemene instellingen van ontkoppelingshulpmiddelen <p class="Jove_content" voor: keep-together.within-page = "1"> Figuur 1: Gereedschappen en apparaten die nodig zijn voor het maken van de geïsoleerde Ommatidia-voorbereiding. De foto's tonen de verschillende apparaten die nodig zijn voor het maken van de geïsoleerde ommatidia voorbereiding, zoals beschreven in het gedetailleerde protocol hierboven. Twee bekers, één gevuld met water ( A ) en de andere gevuld met ethanol ( B ) voor het reinigen van de afbraakpipetten ( D ), die verbonden zijn met de buis ( C ). De dissecting tools zijn: 2 paar fijne en 1 paar grove pincet ( F ) en een retina scooper ( E ). Om de retina scooper voor te bereiden, wordt een micro dissectie naald ( H ) tussen twee draaibankgereedschappen gedraaid die als onderstuk ( G ) werken om de bovenkant van de naald ( I ) te platen. Dan is het verbonden met een langwerpige pi Einde van metaal met lijm ( J ) en gemonteerd op een naaldhouder ( E ). Razor blade chip en houder: Breek een kleine driehoekige chip van een scheermesje af met een razor blade holder ( K ). Het dissectie werkgebied bestaat uit een binoculaire ( L ) en een koele rode lichtbron (( M), ) met twee lichtgeleiders ( N ). De dissectie gereedschappen, inclusief tweezers ( F ), de retina scooper ( E ), bekers ( A en B ), een zaklamp met een rood filter ( Q ) en delicate wissers ( R ) zijn aan beide kanten van de verrekijker geplaatst. Een ijsbak met ES, de FBS-ES, de injectiespuiten voor intracellulaire oplossingen, de 60 mm Petri-schotel ( S ) en de elektrodehouder ( P ) worden ook op de tafel geplaatst. De opnamelektroden worden getrokken met behulp van een horizontale trekker ( T ).E.com/files/ftp_upload/55627/55627fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te zien. Construeer een retina scooper om de retinae te isoleren. Steek de punt (1-4 mm) van een microdissectie naald (entomologische naald, 12 mm lengte, 0,1 mm diameter) tussen de twee wipkaken en platte het door te tikken met een kleine hamer. Monteer de geplateerde naald op een micro-dissecterende naaldhouder (zie de Tafel van Materialen ). Gebruik een paar pincetjes om het vlakke uiteinde van de naald te buigen om een ​​haak met een kromming van ~ 2,5 mm te vormen. Maak trituratiepipetten voor ommatidia-scheiding. Plaats een glazen capillair van 1,2 x 0,68 mm (OD x ID) over een open vlam en brand een poetsmiddel om de opening te verminderen. Meet de grootte van de capillaire opening onder een microscoop. Sorteer de gecreëerde ommatidiale trituratiepipetten in seveN groepen volgens de grootte van hun openingen ( dwz 0,2-0,5 mm). Bewaar ze in aparte geschikte containers ( bijv. Proefbuizen). Vul een kleine beker met dubbel gedestilleerd water (DDW) en een andere kleine beker met ethanol 70%. Bedek elke beker met een paraffine filmplaat. Punch een klein gat in de paraffine filmplaat die de DDW beker (zie afbeelding 1A ) bedekt. Punch zeven kleine gaten in het parafinfolieblad dat de ethanolbekers bedekt en de gaten van 0 tot 6 cijferen (zie figuur 1B ). Plaats een ommatidiale trituratiepipet uit elke groottegroep in elk paraffinefilmgat, zodat de pipet met de grootste opening in het 0 ste gat zit en de pipet met de kleinste opening in het 6e gat bevindt. Sluit een plastic 200 μL pipetpunt aan op een 35 cm lang, 1,57 x 1,14 mm (OD x ID) stuk polyethyleenslang. ConnecT het andere uiteinde van de buis aan een van de ommatidiale trituratiepipetten met de grootste opening ( dwz 0,46 – 0,5 mm), om ervoor te zorgen dat het puntige uiteinde van de trituratiepipet niet in de buis staat. Bereid de hele celopnamepipetten door patchpipetten uit een 1 x 0.58 mm (OD x ID) borosilicaatfilament met glazen capillairen te trekken. OPMERKING: De weerstand van de pipetten moet 8-15 MΩ zijn bij gebruik van intracellulaire oplossing op basis van kaliumgluconaat (IS1). Elk geschikt patchpipetrek kan gebruikt worden (zie bijvoorbeeld de Tabel van Materialen ). Brandpolen is niet nodig. Maak een opnamekamer op (zie figuur 2 ) door een deklaag (zie de Tabel van Materialen ) aan de onderkant van de badkamer te bevestigen met behulp van gesmolten paraffine of hoogvakstof siliconenvet . Gebruik een geschikte zelfgemaakte of commerciële kamer die toegang tot elektroden en perfusie mogelijk maakt. Monteer het bad op het podium van een omgekeerde microscoop. Plaats de buis van het perfusiesysteem, het zuigsysteem en de grond ( dwz Ag-AgCl draad / pellet) in het bad (zie de tabel van materialen en figuur 2 ). Plaats twee paar fijne # 5 pincetjes ( Figuur 1 ) op het werkoppervlak voor gebruik tijdens de retina dissectie en ommatidia isolatie stappen. 3. D. Melanogaster Achteruitgang Raise D. Melanogaster vliegt bij een lage bevolkingsdichtheid ( dwz ~ 20 vliegt in een 6 oz. Fles) in flessen die standaard maïsmeelvoer bij 19-24 ° C bevatten. OPMERKING: Het is beter om te werken aan donkere aangepaste vliegen. Om de hoge gevoeligheid voor licht te behouden, verminder de diversiteit en voorkom retinale degeneratie in mutante vliegen. Achter de vliegen in het donker voor minstens 24 uur voor het experiment. OPMERKING: De vliegen die voor de experimenten werden gebruikt, dienen te zijnNtly verduisterd (<2 uur) en nog steeds zacht, bleek laat het meconium zien. ommatidia kan ook gemakkelijk van poppen worden bereid, hoewel hun gevoeligheid voor licht dan steil afhankelijk is de leeftijd 10 . 4. retina dissectie isolatie: optie 1 opmerking: voer alle volgende stappen uit onder stereoscopische zoommicroscoop met behulp een versterking die geschikt om voorbereiding goed te bekijken (zie afbeelding ). plaats vier druppels es-0ca 2+ druppel ts oplossing op 60 mm petri schotel dat omgedraaid. ruwe pincetten, pak nieuw afgesloten (<2 uur na eclosie) door zijn vleugels of lichaam. vanaf dit punt procedures snel dim rode verlichting bij 20 ± ° c. gebruik eerste paar fijne pincetjes vlieghoofd lichaam los maken terwijl u vlieg pincet vasthoudt. submedraai hoofd in druppel. dissecteer half sagittale vlak tweede pincetjes. zorg ervoor aan eind deze stap beide ogen intact zijn. breng helft over naar andere derde pincetjes, verwijder zoveel mogelijk weefsel oog er geen schade netvlies wordt veroorzaakt. rand hoornvlies schop scooper. afloop zal leeg worden, gescheiden intacte retina. spoel trituratiepipet ddw aangesloten, vul pipet kleine hoeveelheid vierde moet elke keer uitgevoerd als nieuwe ommatidia-scheidingspipet gebruikt verwijderd vorenm ethanolbeker (de vult overeenkomen waarin onderdompeld is). voorzichtig mond geïsoleerde trekken. wees uiterst luchtbellen niet streven. ts. 4.6-4.10 oog. delicate doekjes, waarbij alleen retinae petri-schotel bevat, weglaten. voeg zes toe top petri-schotel. retinas één ts-druppels over. vervang opening kleinere diameter. zoals beschreven 4.8, vullen. herhaaldelijk aspireren vervallen afscheiding beginnen, pigmentcellen hele zichtbaar ts-daling, isolatieproces vordert, ts-daling minder doorschijnend. overige ts-daling. voormalige ts-druppel (met ommatidia) doei badkamer. herhaal 4.12-4.14 maximale bereiken. wacht ongeveer minuut laten zinken binden bodem perfusiesysteem start stroming 1,5 ca kamer volledig gevuld, boven, grond ondergedompeld. blijf bad 4-5x wassen. 5. 2 zoommicroscoop, amplificatie figuur bereid razor blade chip houder. afbreek monteer driehoekige scheermesje holder ( siliconen >

Representative Results

De beschreven methode heeft de nauwkeurige registratie van de fundamentele eenheidstromen mogelijk die spontane en lichtgemaakte kwantumstoten genereren, die de macroscopische respons op licht produceren onder bepaalde omstandigheden. Het liet ook de vergelijking tussen wildtype en mutantvliegen toe die defecten hebben in kritische signaalmoleculen ( figuren 3 en 5 ) 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Bovendien bleek het vermogen om terugkeerpotentieel te meten onder biionische omstandigheden de fundamentele biofysische eigenschappen van de TRP- en TRP-achtige (TRPL) kanalen 18 , 19 . Het zorgde ook voor de meting van de effecten van aminozuur substituties in het poriëngebied van TRP dat zijn Ca 2+ veranderdeDoorlaatbaarheid 20 . Het lichte antwoord verkregen door patchclamp-heel-cel opnames hangt lineair af van de lichtintensiteit voor ten minste 4 grootteordeningen. Dit kan niet opgelost worden door gebruik te maken van ERG- en intracellulaire opnamemethoden. Bijgevolg bleek een reeks reacties op korte flitsen van toenemende intensiteit en een plot van de intensiteitsresponsfunctie een strikte lineariteit van de flitsrespons met toenemende lichtintensiteit. De strikte lineariteit duurt tenminste een paar honderd pA, maar het is debatbaar of er vervolgens lineariteit of klemregeling is die afbreekt ( figuur 6 ). Deze resultaten suggereren dat de macroscopische reacties op het licht een lineaire opsomming zijn van de unitaire responsen op licht ( dwz kwantumstoten). Het is goed gevestigd met behulp van spanningsopnames die dim stimulatie indemenUces discrete spanningsfluctuaties ( dwz kwantumstoten) bij de meeste ongewervelde soorten. De D. melanogaster quantum bumps komen uit de gecoördineerde opening van ~ 15 TRP kanalen en ~ 2 TRPL kanalen op de top van de bump 18 . Elke stoot wordt gegenereerd door de opname van een enkel foton, terwijl de macroscopische respons op meer intense lichten de summatie van deze elementaire reacties 14 , 21 is . De hobbels variëren aanzienlijk in latentie, tijdcursus en amplitude, zelfs wanneer de stimulusomstandigheden identiek zijn. Bumpgeneratie is een stochastisch proces dat wordt beschreven door Poisson-statistieken, waarbij elke effectief geabsorbeerde foton slechts één bult uitstraalt. De single-foton-single-bump relatie vereist dat elke stap in de cascade niet alleen een efficiënt "turn-on" -mechanisme bevat, maar ook een even effectief "uitschakel" -mechanisme. Het functionele voordeel is de productie van aZeer gevoelige fotonenteller met een snelle transiënte respons, zeer geschikt voor zowel de gevoeligheid als de tijdelijke resolutie die door het visuele systeem nodig is. De eis voor een efficiënt uitschakelmechanisme wordt aangetoond wanneer het actieve fotopigment ( dat wil zeggen metarhodopsin, M) of het doel ervan, de G q α, niet inactivert en leidt tot de voortdurende productie van bultjes lang nadat het licht is uitgeschakeld ( figuur 3 ) 15 , 22 , 23 , 24 . De bump vertegenwoordigt de coöperatieve activiteit van de TRP / TRPL kanalen in een microvillus. Als zodanig moet elke hypothese van kanaalactivatie ook coöperatieve kanaalactivering verklaren. Recentelijk hebben Hardie en collega's aangetoond dat licht een snelle samentrekking van de fotoreceptoren oproept, wat suggereert dat de lichtgevoeligeE kanalen (TRP / TRPL) kunnen mechanisch gated zijn 25 . Deze mechanische activatie, samen met de waargenomen protonen die door PLC-gemedieerde PIP 2- hydrolyse worden vrijgegeven, bevorderen de opening van de TRP / TRPL kanalen en verklaren de coöperatieve aard van de bumpproductie 26 . Momenteel zijn D. melanogaster fotoreceptoren een van de weinige systemen waarin fosfoinositide signalering en TRP kanalen in vivo kunnen worden bestudeerd , waardoor D. melanogaster phototransduction en de methodologie ontwikkeld om dit mechanisme een zeer waardevol model systeem te bestuderen. Figuur 3: De inaC P209 en inaD P215 Mutanten onthullen Slow Response Beëindiging van het Macroscopische Respons op Licht en van de Single Quantum Bumps. ( A ) De geïsoleerde ommatidiumprepaRantsoen met een patchpipet gevuld met fluorescerende Lucifer Yellow CH kleurstof (excitatie: 430 nm, emissie: 540 nm) wordt gepresenteerd tijdens een volledige opname van een cel. Merk op dat de fluorescerende kleurstof een enkel fotoreceptor cellichaam verspreidde en gemerkt heeft en dat de fotoreceptor cellichamen los zijn van hun langwerpige axonen, maar toch levensvatbaarheid behouden. Dit preparaat is geschikt voor gelijktijdige full-cell opnames en imaging experimenten. ( BD ) Bovenste panelen: Geheel-spanningsklemmen kwantumbumpreacties op continu dimlicht (open staaf) in WT, inaC P209 en inaD P215 mutantvliegen . Een langzame beëindiging van de stoten wordt waargenomen in inaC P209 en inaD P215 mutanten ten opzichte van WT vliegen. De onderstaande inzet toont de vergrote vorm van enkele stoten. Bodempanelen: Genormaliseerde macroscopische reacties van hele cellen op een 500-ms lichtpuls (1,5 x 10 5 fotonen per s) van de bovengenoemde wildtype En mutante vliegen. (EG) Bovenste panelen: Volle celspanningsklemmen kwantumbotsreacties op een korte (1 ms) dimlichtende single-foton respons in wildtype, arr2 3 en ninaC P235 mutantvliegen . Let op de treinstoot waargenomen in arr2 3 en ninaC P235 mutantvliegen als reactie op een enkele fotonabsorptie. Onderpanelen: Volkscelspanning klemde genormaliseerde reacties op een 500 ms lichtpuls (1,5 x 104 fotonen / s) in de overeenkomstige mutanten. Let op de langzame beëindiging van de macroscopische reacties waargenomen in arr2 3 En ninaC P235 mutant vliegen ten opzichte van WT. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. D / 55627 / 55627fig4.jpg "/> Figuur 4: Cellulaire Ca 2+ Dynamica Na aanleiding van door de signaal geïnduceerde Ca 2+ Influx wordt beïnvloed door Calphotin. Een tijdreeks van fotoreceptorbeelden van wildtype en Cpn 1% vliegen die de fluorescentie van de Ca 2+ -indicator tonen tijdens lichtstimulatie. Ruwintensiteitbeelden worden getekend met behulp van valse kleurcodering (bar = 10 μm; pijlpunten geven de pipet aan). Figuur herdrukt met toestemming van Weiss et al. 4 . Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 5: De elektrofysiologische eigenschappen van WT-, trp- en trpl-mutanten. ( A ) Whole-cell voltage clamp recoRdings van quantum bumps in reactie op continu dim light (open bar) in WT, trpl 302 en trp P343 null mutant vliegen. Zeer verminderde amplitude van trp P34 3 stoten worden waargenomen. Inset: Vergrote single quantum bumps van wildtype en trp P343 null mutant vliegen worden getoond. ( B ) Whole-cell voltage clamp opnames in reactie op een 3 s lichtpuls van wildtype en de overeenkomstige mutanten. De transiënte steady state reactie van de trp P343 mutant wordt waargenomen . Inset: Vergrote lichte responsen van WT en trp P343 mutant worden getoond. ( C ) Een familie van overbelichte lichtgeïnduceerde stromingen van de bovengenoemde vliegstammen, opgewekt als reactie op een 20 ms lichtpuls, bij spanningsstappen van 3 mV, gemeten rond de omkeerpotentiaal (E rev ). ( D ) Een histogram dat de gemiddelde E rev van wildtype en de verschillende mutan plottets. De foutbalken zijn de SEM De omkeerpotentieel (E rev ) van WT ligt tussen de positieve E rev van trpl 302 , die alleen TRP uitmaakt en de E rev van de trp P343 null mutant, die alleen TRPL uitmaakt. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 6: De flitsrespons is strikt lineair met toenemende lichtintensiteit. Een reeks actuele reacties op korte flitsen van toenemende lichtintensiteit en een plot van de afhankelijkheid van de piekamplitude van het lichtrespons op de toenemende intensiteit van korte lichtflitsen. Deze relatie laat een strikte lineariteit zien tussen de flitsrespons en de toenemende lichtintensiteit. Deze strenge lineariteitBevat tenminste een paar honderd pA, met lichtintensiteit die meer dan 4 orders van grootte overschrijdt, terwijl het debat kan zijn of het lineariteit of de klemregeling daaruit is. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. pH 7,15 (pas met NaOH) Reagens Concentratie (mM) NaCl 120 KCl 5 MgCl2 4 TES 10 proline 25 alanine 5 Bewaren bij -20 ° C. <td colspan= "2"> Opmerking: Deze oplossing is nominaal Ca 2+ vrij, maar heeft geen Ca 2+ buffers toegevoegd en heeft derhalve ongeveer 5 – 10 μM trace Ca 2+ . Extracellulaire oplossing (ES) = ES-0Ca 2+ met 1,5 mM CaCl2, gemaakt door CaCl2 toe te voegen uit een 0,5 of 1 M voorraadoplossing aan ES-0Ca 2+ . Tabel 1: Ca +2- vrije extracellulaire oplossing (ES). Chemische beschrijving en de specifieke hoeveelheden die nodig zijn om Ca +2 -vrij ES te produceren. Reagens Bedrag FBS 15 ml sucrose 1,5 g Verdeel in 150 μl porties in 1,5 ml flacons en sla het op -20 76; C. Trituratieoplossing (TS) Vul 1 injectieflacon met 150 ml voorraadoplossing met 1,350 ml ES of ES-0Ca 2+ , om de oplossing te gebruiken die tijdens de dissectie wordt gebruikt. Tabel 2: Fetische Bovine Serum (FBS) + Sucrose – Voorraadoplossing. Chemische beschrijving en de specifieke hoeveelheden die nodig zijn voor het produceren van foetale boviene serum (FBS) + sucrose-voorraadoplossing. pH 7.15 (pas bij KOH) Reagens Concentratie (mM) Kaliumgluconaat (Kglu) 140 MgCl2 2 TES 10 ATP magnesiumzout (MgATP) 4 GTP natriumzout (Na2 GTP) 0.4 Β-Nicotinamide-adenine-dinucleotidehydraat (NAD) 1 Bewaren bij -20 ° C. Tabel 3: Intracellulaire Oplossing (IS1). Chemische beschrijving en de specifieke hoeveelheden die nodig zijn voor het produceren van IS1, die voornamelijk wordt gebruikt voor intensiteitsrespons en kwantumbumpmetingen. pH 7,15 (pas bij CsOH) Reagens Concentratie (mM) CsCl 120 MgCl2 2 TES 10 ATP magnesiumzout (MgATP) 4 GTP natriumzout (Na2 GTP) 0.4 Β-Nicotinamide-adenine-dinucleotidehydraat (NAD) 1 Tetraethyl-ammoniumchloride (TAE) 15 Bewaren bij -20 ° C. Tabel 4: Intracellulaire Oplossing (IS2). Chemische omschrijving en de specifieke hoeveelheden die nodig zijn om intracellulaire oplossing IS2 te produceren, die voornamelijk gebruikt wordt voor omkerende potentiële metingen van de licht geïnduceerde stroom.

Discussion

De toepassing van hele cel opnames op D. melanogaster fotoreceptoren toegestaan ​​voor de ontdekking en de functionele toelichting van nieuwe signalering eiwitten, zoals TRP kanalen 27 , 28 , 29 en INAD 30 , 31 , 32 steiger eiwit. Sinds de initiële introductie van deze techniek heeft het de oplossing van langetermijnvraagstukken over het ionische mechanisme en spanningsafhankelijkheid van het lichtrespons mogelijk gemaakt. Dit gebeurde door het toegewezen vermogen om de membraanspanning en extracellulaire en intracellulaire ionische samenstelling 19 , 28 nauwkeurig te regelen.

Een belangrijk obstakel van de patch klemmethode in D. melanogaster is de fragiliteit van de geïsoleerde ommatidia preparantsoen. Uitgebreide studies hebben aangetoond dat de integriteit van de phototransductiemachines kritisch hangt af van de doorlopende levering van ATP, vooral bij lichtbelichting, wat leidt tot een groot verbruik van ATP. Helaas elimineert de mechanische striping van de pigmenten ( dwz glia) cellen, die nodig zijn om het fotoreceptormembraan met de patchpipet te bereiken, de belangrijkste bron van metabolieten die nodig zijn voor ATP-productie 33 . Toepassing van exogene ATP in de opnamepipet voldoet slechts gedeeltelijk aan de eis voor grote hoeveelheden ATP. Een tekort aan ATP leidt tot spontane activering van de TRP kanalen en naar de dissociatie van de phototransduction machines van de licht geactiveerde kanalen, waardoor een grote toename van cellulaire Ca 2+ en de afschaffing van de normale respons op licht 34 , 35 wordt veroorzaakt. Deze reeks gebeurtenissen is niet te wijten aan schade aan deFotoreceptoren door de dissectieprocedure, maar liever naar de cellulaire depletie van ATP. Om te voorkomen dat deze volgorde van gebeurtenissen optreedt en om normale lichteffecten te handhaven, mogen de fotoreceptoren niet worden blootgesteld aan intense lichten, die grote hoeveelheden ATP verbruiken. Ook moet NAD in de opnamepipet opgenomen worden, vermoedelijk om ATP-productie in de mitochondria 18 , 36 te vergemakkelijken. Voor de metingen van spontane en kwantumstoten is de bovengenoemde moeilijkheid minimaal omdat alleen dimlichten worden gebruikt. In de praktijk kan een stabiele hele-cel opname worden gehandhaafd voor ~ 20-25 minuten, hoewel er een tendens is voor reactiekinetiek om gedurende deze periode te vertragen. Een enkele bereiding van gedisocieerd ommatidia kan tot 2 uur levensvatbaar blijven.

Een bijkomende tekortkoming van de geïsoleerde ommatidiapreparatie is de ontoegankelijkheid van de microvilli, die vertaalt naar de ontoegankelijkheid van de TRP enTRPL kanalen naar de opnamepipet, waardoor opnamen met een kanaal worden voorkomen. Met behulp van een methode die ze ontwikkelden, slaagde Bacigalupo en collega's erin om directe opnamen uit de rhabdomere 37 direct op te nemen . Deze kanaalactiviteit verschilt echter van die van TRPL kanalen die heterologisch tot expressie komen in weefselkweekcellen 38 en van TRP-kanaalactiviteit afgeleid van schotgeluidsanalyse verkregen uit geïsoleerde ommatidia 34 . Vermoedelijk beschadigde de dissectieprocedure de fotoreceptorcellen bij het gebruik van deze methode.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Het experimentele deel van dit onderzoek werd ondersteund door subsidies van de VS-Israël Bi National Science Foundation (BM en IL), de Israëlische Science Foundation (ISF), de Deutsch-Israëlische Projektkooperatie (DIP) (naar BM) en de Biotechnologie En Onderzoeksraad Biologische Wetenschappen (BBSRC Grant-nummers: BB / M007006 / 1 en BB / D007585 / 1) naar RCH

Materials

10 ml syringe
5 ml syringe
1 ml syringe with elongated tip
Petri dish 60 mm
Silicone dissection dish/block Dow Corning Sylguard 184 Silicone Elastomer Kit Throughly mix both components, pour into mould and cure for 2 hours at 60ᵒC
Syringe filters Millex 22 µm PVDF filter 
Capillaries (for omatidia separation) Glass, 1.2 x 0.68 mm (~7.5 cm each)
Polyethylene Tubing Becton Dickinson 1.57 x 1.14 mm (35 cm)
 2 small beakers 50 ml or less
2 paraffin film sheets Parafilm M ~5 x 5 cm
Bath chamber home made
Cover slips 22 x 22 mm No. 0
Paraplast Plus Sigma Paraffin – polyisobutylene mixture To glue the coverslip onto the bottom of the bath chamber
Ground Warner Instruments  64-1288 Hybrid Assembly Ag-AgCl Wire Assembly
Headless micro dissection needle Entomology, 12 mm
Micro dissecting needle holder
Vise
2 fine tweezers + 1 rough tweezers Dumont #5, Biology  0.05 x 0.02 mm, length 110 mm, Inox
Stereoscopic zoom Microscope  Nikon SMZ-2B
Cold light source Schott KL1500 LCD
Filter (Color) for cold light source Schott RG620
Delicate wipers Kimtech Kimwipes
Electrode holder Warner Instruments QSW-T10P Q series Holders compatible with Axon amplifiers, straight body style
Silver Wire Warner Instruments 0.25 mm diameter, needs to be chloridized
Micromanipulator Sutter Instruments MP 85 Huxley-Wall Style Micromanipulator
Faraday cage home made Electromagnetic noise shielding and black front curtain
Anti-vibration Table Newport VW-3036-OPT-01
Osilloscope GW GOS-622G
Perfusion system Warner Instruments VC-8P Pinch valve control system
Perfusion valve controller Scientific instruments BPS-8
Suction system
Amplifier Molecular Device Axopatch-1D
Head-stage Molecular Device CV – 4 Gain: x 1/100
A/D converter Molecular Device Digidata 1440A
Clampex Molecular Device 10 software
pCLAMP Molecular Device 10 software
Light source (Xenon Arc lamp) Sutter Instruments Lambda LS
Light detector home made phototransistor
Filter wheel and shutter controller Sutter Instruments Lambda 10-2 with a Uniblitz shutter
Filters (Natural density filter) Chroma 6,5,4,3,2,1,0.5,0.3
Filter (Color) Schott OG590, Edge filter
Xenon Flash Lamp system Dr. Rapp OptoElecftronic JML-C2
Light guide Quartz 
Pulse generator AMPI Master 8
Microscope Olympus IX71, Inverted
Red illumination filter (Microscope) RG630 / RG645 ø45mm
Microscope objective Olympus X60/0.9 UplanFL N air or X60/1.25 UplanFI oil
CCD Camera Andor iXon DU885K
NIS Element  Nikon AR software
Ca+2 indicator Invitrogen Calcium green 5N
Excitation & emission filters and dichroic mirror Chroma 19002 – AT – GFP/FITC Longpass set
Vertical pipette puller Narishige  Model PP83 Use either vertical or horizontal puller, as preferred.
Horizontal pipette puller Sutter Instrument  Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette Puller
Filament Sutter Instrument 3 mm trough or square box
Capillaries Harvard Apparatus borosilicate glass capillaries 1 x 0.58 mm
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hardie, R. C. Whole-cell recordings of the light induced current in dissociated Drosophila photoreceptors: evidence for feedback by calcium permeating the light-sensitive channels. Proc. R. Soc. Lond. B. 245, 203-210 (1991).
  2. Ranganathan, R., Harris, G. L., Stevens, C. F., Zuker, C. S. A Drosophila mutant defective in extracellular calcium- dependent photoreceptor deactivation and rapid desensitization. Nature. 354, 230-232 (1991).
  3. Martin, J. H., Benzer, S., Rudnicka, M., Miller, C. A. Calphotin: a Drosophila photoreceptor cell calcium-binding protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (4), 1531-1535 (1993).
  4. Weiss, S., et al. Compartmentalization and Ca2+ buffering are essential for prevention of light-induced retinal degeneration. J Neurosci. 32 (42), 14696-14708 (2012).
  5. Wang, T., et al. Light activation, adaptation, and cell survival functions of the Na + /Ca 2+ exchanger CalX. Neuron. 45 (3), 367-378 (2005).
  6. Weckstrom, M., Hardie, R. C., Laughlin, S. B. Voltage-activated potassium channels in blowfly photoreceptors and their role in light adaptation. J. Physiol. Lond. 440, (1991).
  7. Frolov, R. V., Immonen, E. V., Weckström, M. Performance of blue- and green-sensitive photoreceptors of the cricket Gryllus bimaculatus. J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 200 (3), 209-219 (2014).
  8. Nasi, E. Whole-cell clamp of dissociated photoreceptors from the eye of Lima scabra. J Gen Physiol. 97 (1), 35-54 (1991).
  9. Nasi, E., Gomez, M. P. Light-activated ion channels in solitary photoreceptors of the scallop Pecten irradians. J. Gen. Physiol. 99, 747-769 (1992).
  10. Hardie, R. C., Peretz, A., Pollock, J. A., Minke, B. Ca 2+ limits the development of the light response in Drosophila photoreceptors. Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 252, 223-229 (1993).
  11. Kohn, E., et al. Functional Cooperation between the IP3 Receptor and Phospholipase C Secures the High Sensitivity to Light of Drosophila Photoreceptors In Vivo. J Neurosci. 35 (6), 2530-2546 (2015).
  12. Hevers, W., Hardie, R. C. Serotonin modulates the voltage dependence of delayed rectifier and Shaker potassium channels in Drosophila photoreceptors. Neuron. 14 (4), 845-856 (1995).
  13. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  14. Henderson, S. R., Reuss, H., Hardie, R. C. Single photon responses in Drosophila photoreceptors and their regulation by Ca 2. J. Physiol. Lond. 524 (Pt 1), 179-194 (2000).
  15. Scott, K., Zuker, C. S. Assembly of the Drosophila phototransduction cascade into a signalling complex shapes elementary responses. Nature. 395 (6704), 805-808 (1998).
  16. Elia, N., Frechter, S., Gedi, Y., Minke, B., Selinger, Z. Excess of G betae over G qalphae in vivo prevents dark, spontaneous activity of Drosophila photoreceptors. J. Cell Biol. 171 (3), 517-526 (2005).
  17. Katz, B., Minke, B. Phospholipase C-Mediated Suppression of Dark Noise Enables Single-Photon Detection in Drosophila Photoreceptors. J. Neurosci. 32 (8), 2722-2733 (2012).
  18. Hardie, R. C., et al. Molecular basis of amplification in Drosophila phototransduction. Roles for G protein, phospholipase C, and diacylglycerol kinase. Neuron. 36 (4), 689-701 (2002).
  19. Reuss, H., Mojet, M. H., Chyb, S., Hardie, R. C. In vivo analysis of the Drosophila light-sensitive channels, TRP and TRPL. Neuron. 19, 1249-1259 (1997).
  20. Liu, C. H., et al. In vivo identification and manipulation of the Ca 2+ selectivity filter in the Drosophila transient receptor potential channel. J. Neurosci. 27 (3), 604-615 (2007).
  21. Ahmad, S. T., Natochin, M., Barren, B., Artemyev, N. O., O’Tousa, J. E. Heterologous expression of bovine rhodopsin in Drosophila photoreceptor cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (9), 3722-3728 (2006).
  22. Scott, K., Sun, Y., Beckingham, K., Zuker, C. S. Calmodulin regulation of Drosophila light-activated channels and receptor function mediates termination of the light response in vivo. Cell. 91 (3), 375-383 (1997).
  23. Liu, C. H., et al. Ca 2+ -dependent metarhodopsin inactivation mediated by calmodulin and NINAC myosin III. Neuron. 59 (5), 778-789 (2008).
  24. Cook, B., et al. Phospholipase C and termination of G-protein-mediated signalling in vivo. Nat. Cell Biol. 2 (5), 296-301 (2000).
  25. Hardie, R. C., Franze, K. Photomechanical responses in Drosophila photoreceptors. Science. 338 (6104), 260-263 (2012).
  26. Huang, J., et al. Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors. Curr. Biol. 20 (3), 189-197 (2010).
  27. Minke, B., Wu, C. F., Pak, W. L. Isolation of light-induce response of the central retinular cells from the electroretinogram of Drosophila. J. Comp. Physiol. 98, 345-355 (1975).
  28. Hardie, R. C., Minke, B. The trp gene is essential for a light-activated Ca2+ channel in Drosophila photoreceptors. Neuron. 8, 643-651 (1992).
  29. Niemeyer, B. A., Suzuki, E., Scott, K., Jalink, K., Zuker, C. S. The Drosophila light-activated conductance is composed of the two channels TRP and TRPL. Cell. 85 (5), 651-659 (1996).
  30. Huber, A., et al. The transient receptor potential protein (Trp), a putative store- operated Ca 2+ channel essential for phosphoinositide-mediated photoreception, forms a signaling complex with NorpA, InaC and InaD. EMBO J. 15 (24), 7036-7045 (1996).
  31. Shieh, B. H., Niemeyer, B. A novel protein encoded by the InaD gene regulates recovery of visual transduction in Drosophila. Neuron. 14 (1), 201-210 (1995).
  32. Tsunoda, S., et al. A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade. Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).
  33. Tsacopoulos, M., Veuthey, A. L., Saravelos, S. G., Perrottet, P., Tsoupras, G. Glial cells transform glucose to alanine, which fuels the neurons in the honeybee retina. J. Neurosci. 14 (3 Pt 1), 1339-1351 (1994).
  34. Hardie, R. C., Minke, B. Spontaneous activation of light-sensitive channels in Drosophila photoreceptors. J. Gen. Physiol. 103, 389-407 (1994).
  35. Agam, K., et al. Metabolic stress reversibly activates the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL in vivo. J Neurosci. 20 (15), 5748-5755 (2000).
  36. Agam, K., Frechter, S., Minke, B. Activation of the Drosophila TRP and TRPL channels requires both Ca2+ and protein dephosphorylation. Cell Calcium. 35 (2), 87-105 (2004).
  37. Delgado, R., Muñoz, Y., Peña-Cortés, H., Giavalisco, P., Bacigalupo, J. Diacylglycerol activates the light-dependent channel TRP in the photosensitive microvilli of Drosophila melanogaster photoreceptors. J Neurosci. 34 (19), 6679-6686 (2014).
  38. Parnas, M., Katz, B., Minke, B. Open channel block by Ca2+ underlies the voltage dependence of Drosophila TRPL channel. J. Gen. Physiol. 129 (1), 17-28 (2007).

Tags

Keywords: ElectrophysiologyWhole-cell Voltage ClampDrosophilaPhotoreceptorsPhototransductionTRP ChannelsVisual TransductionDissectionCalcium-free Extracellular SolutionInverted MicroscopePerfusion SystemSuction SystemGround WireElectrophysiology Setup
check_url/cn/55627?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Katz, B., Gutorov, R., Rhodes-Mordov, E., Hardie, R. C., Minke, B. Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors. J. Vis. Exp. (124), e55627, doi:10.3791/55627 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image