طريقة الكهربية لالكامل خلية الجهد المشبك تسجيلات من<em> ذبابة الفاكهة</em> المستقبلات الضوئية
Summary
تسجيلات خلية كاملة من مستقبلات ذبابة الفاكهة ميلانوغاستر تمكن من قياس المطبات السوداء العفوية، المطبات الكم، والاستجابات العيانية للضوء، والعلاقات الحالية الجهد في ظل ظروف مختلفة. في تركيبة مع D. ميلانوغاستر أدوات التلاعب الجيني، وهذه الطريقة تمكن من دراسة في كل مكان إينوزيتول الدهون مسار الإشارات وهدفها، وقناة ترب.
Abstract
وقد سجلت ثنائيات التسجيلات المشعة ذات الجهد الكامل من مستشعرات ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة ثورة في مجال التنغيم البصري اللافقاري، مما مكن من استخدام علم الوراثة الجزيئي ميلانوغاستر لدراسة قنوات التشفير الدهني للأنوزيتول وقنوات المستقبلات المؤقتة (ترب) على مستوى الجزيء الواحد. وقد اتقن حفنة من المختبرات هذه التقنية القوية، والتي تمكن من تحليل الاستجابات الفسيولوجية للضوء في ظل ظروف عالية التحكم. هذه التقنية تسمح للسيطرة على وسائل الإعلام داخل الخلايا وخارج الخلية. الغشاء الجهد؛ والتطبيق السريع للمركبات الدوائية، مثل مجموعة متنوعة من المؤشرات الأيونية أو الرقم الهيدروجيني، إلى وسائل الإعلام داخل وخارج الخلية. مع ارتفاع نسبة إشارة إلى الضوضاء بشكل استثنائي، وهذا الأسلوب يتيح قياس الظلام عفوية والتيارات التي يسببها ضوء التيتانيوم ( أي المطبات العفوية والكمية) والميكروسكوبية التي يسببها التيارات الخفيفة (ليك) من الخطيئةغل D. ميلانوغاستر فوتوريبتورس. ويوضح هذا البروتوكول، بتفصيل كبير، جميع الخطوات الرئيسية اللازمة لأداء هذه التقنية، والذي يتضمن كل من التسجيلات الكهربية والبصرية. ويصف الإجراء تشريح الشبكية ذبابة لتحقيق سليمة وقابلة للحياة خارج الجسم الحي معزولة أوماتيديا في غرفة حمام. كما يتم تفصيل المعدات اللازمة لأداء كامل الخلية والقياسات التصوير مضان أيضا. وأخيرا، يتم شرح المزالق في استخدام هذا التحضير الدقيق خلال التجارب الموسعة.
Introduction
وقد وضعت الدراسات الوراثية واسعة من ذبابة الفاكهة، ذبابة الفاكهة ميلانوغاستر ( D. ميلانوغاستر) ، التي بدأت منذ أكثر من 100 سنة، D. ميلانوغاستر يطير كنموذج تجريبي مفيد للغاية للتشريح الجيني للعمليات البيولوجية المعقدة. المنهجية الموصوفة أدناه يجمع بين القوة المتراكمة لل D. ميلانوغاستر الوراثة الجزيئية مع نسبة الإشارة إلى الضوضاء عالية من كامل خلية التصحيح المشبك التسجيلات. هذا الجمع يسمح لدراسة D. ميلانوغاستر فوتوترانزدكتيون كنموذج للإشارة إينوزيتول والدهون وتنظيم قناة ترب وتنشيط، سواء في البيئة الأصلية وعلى أعلى دقة من جزيئات واحدة.
تطبيق طريقة تسجيل الخلية بأكملها إلى D. مستقبلات ميلانوغاستر قد أحدثت ثورة في دراسة فوتوترانزكتيون اللافقاريات. وقد تم تطوير هذه الطريقة من قبل هاردي 1 و إندبفي نهاية المطاف من قبل رانغاناثان وزملاؤه قبل 2 ~ 26 عاما، وكان يهدف إلى استغلال أدوات التلاعب الوراثي واسعة من D. ميلانوغاستر واستخدامها للكشف عن آليات فوتوترانزكتيون وإشارة الأينوزيتول والدهون. في البداية، عانت هذه التقنية من انخفاض سريع في حساسية الضوء وانخفاض العائد من أوماتيديا أثناء عملية تشريح، مما منع الدراسات الكمية مفصلة. في وقت لاحق، إضافة أتب و ناد إلى ماصة التصحيح زيادة كبيرة في ملاءمة إعداد للتسجيلات الكمية لفترات طويلة. وبعد ذلك، تم توصيف واسع النطاق لآلية تنبيغ الإشارة على المستوى الجزيئي.
حاليا، D. ميلانوغاستر فوتوترانسكتيون هو واحد من عدد قليل من النظم التي فوسفوانوسيتيد إشارات وقنوات ترب يمكن دراستها خارج الجسم الحي في قرار جزيء واحد. وهذا يجعل D. ميلانوغاستر فوتروترانزكتيون و ليثودولوغي وضعت لدراسة هذه الآلية نظام نموذج حساس للغاية. يصف هذا البروتوكول كيفية تشريح الشبكية ميلانوغاستر و ميكانيكالي قطاع أوماتيديا معزولة من الصباغ المحيطة (الدبقية) الخلايا. وهذا يتيح تشكيل الختم جيغا وكامل خلية التصحيح المشبك على الهيئات الخلية مبصرة. لحسن الحظ، فإن معظم بروتينات التشوير تقتصر على ربدومير ولا تنتشر. بالإضافة إلى ذلك، هناك كا 2 + عازلة عازلة غير قابلة للحركة دعا كالفوتين، وتقع بين مقصورة الإشارات وجسم الخلية 3 ، 4 ، ومستوى التعبير عالية من نا + / كا 2 + مبادل (كالكه) في ميكروفيلي 5 . معا، حبس البروتين إلى رابدومير، العازلة كالفوتين، والتعبير عالية من كالك تسمح لفترة طويلة نسبيا ( أي ما يصل إلى ~ 20 دقيقة) تسجيلات خلية كاملة، دون فقدان المكونات الأساسيةمن عملية فوتوترانسكتيون مع الحفاظ على حساسية عالية للضوء. يصف البروتوكول التالي كيفية الحصول على أوماتيديا معزولة وأداء التسجيلات خلية كاملة التي تظهر للحفاظ على الخصائص الأصلية للتسلسل فوتوترانزدكتيون. تم إجراء التجارب كاملة المشبك خلية التصحيح على صرصور فصل ( بيريبلانيتا أميريكانا ) 6 والكريكيت ( غريلوس بيماكولاتوس ) 7 أوماتيديا على نحو مماثل لتلك التي وصفها D. ميلانوغاستر . بالإضافة إلى ذلك، تم إجراء التجارب المشبك التصحيح على مستقبلات ضوئية فصل من البطلينوس الملف، ( ليما سكابرا ) والاسكالوب ( بكتن إراديانز ) بطريقة مختلفة قليلا عن تلك التي أجريت على D. ميلانوغاستر ، مما يسمح لكل خلية كاملة 8 وقياسات قناة واحدة 9 – هنا، وصفت الإنجازات الرئيسية التي تم الحصول عليها في D. ميلانوغاستر باستخدام هذه التقنية. المناقشة طيصف وصف بعض المزالق والقيود المفروضة على هذه التقنية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تطبيق التسجيلات خلية كاملة ل D. ميلانوغاستر المستقبلات الضوئية يسمح لاكتشاف والوظيفي توضيح بروتينات التشوير الجديدة، مثل قنوات ترب 27 ، 28 ، 29 و إيناد 30 ، 31 ، 32 بروتين سقالة. من أي وقت مضى منذ إدخال الأولي لهذه التقنية، فإنه مكن من حل المسائل الأساسية على المدى الطويل فيما يتعلق بالآلية الأيونية والجهد الاعتماد على استجابة الضوء. حدث هذا بسبب القدرة الممنوحة على التحكم بدقة في الجهد الغشاء وخارج الخلية وتكوين الأيونية داخل الخلايا 19 ، 28 .
وكانت عقبة رئيسية من تقنية لقط التصحيح في D. ميلانوغاستر هشاشة معزولة أوماتيديبا بريباحصة. وقد كشفت الدراسات التفصيلية أن سلامة الآلات فوتوترانسكتيون يعتمد بشكل حاد على العرض المستمر من أتب، وخصوصا أثناء التعرض للضوء، الأمر الذي يؤدي إلى استهلاك كبير من أتب. لسوء الحظ، والشريط الميكانيكية للخلايا الصباغ ( أي الدبقية)، وهو مطلوب للوصول إلى غشاء مبصرة مع ماصة التصحيح، ويزيل المصدر الرئيسي من الأيضات اللازمة لإنتاج أتب 33 . تطبيق أتب خارجي في ماصة تسجيل يستوفي جزئيا فقط متطلبات لكميات كبيرة من أتب. نقص المعروض من أتب يؤدي إلى تفعيل عفوية للقنوات ترب وإلى تفكك الآلات فوتوترانسكتيون من القنوات تنشيط الضوء، مما تسبب في زيادة كبيرة في كا 2 الخلوية + وإلغاء الاستجابة الطبيعية للضوء 34 ، 35 . هذا التسلسل من الأحداث ليس بسبب الضرر منمستقبلات ضوئية من خلال إجراء تشريح، ولكن بدلا من استنفاد الخلوية من أتب. لمنع هذا التسلسل من الأحداث من حدوث والحفاظ على استجابات الضوء الطبيعي، لا ينبغي أن تتعرض مستقبلات ضوئية لأضواء مكثفة، والتي تستهلك كميات كبيرة من أتب. أيضا، ناد يجب أن تدرج في ماصة تسجيل، ويفترض لتسهيل إنتاج أتب في الميتوكوندريا 18 ، 36 . لقياسات العفوية والكمية المطبات، وصعوبة أعلاه هو الحد الأدنى لأن فقط أضواء خافتة تستخدم. في الممارسة العملية، يمكن الحفاظ على تسجيل خلية كاملة مستقرة لمدة ~ 20-25 دقيقة، على الرغم من أن هناك ميل لحركية الاستجابة لإبطاء خلال هذه الفترة. قد يبقى إعداد واحد من أوماتيديا انفصال قابلة للحياة لمدة تصل إلى 2 ساعة.
وهناك عيب إضافي في إعداد أوماتيديا معزولة هو عدم إمكانية الوصول إلى ميكروفيلي، مما يترجم إلى عدم إمكانية الوصول إلى ترب وقنوات تربل إلى ماصة تسجيل، ومنع التسجيلات قناة واحدة. وباستخدام طريقة طوروها، نجح باسيغالوبو وزملاؤه في تسجيل نشاط قناة واحدة مباشرة من ربدومير 37 . ومع ذلك، يختلف هذا النشاط قناة من تلك القنوات تربل أعرب متغايرة في خلايا زراعة الأنسجة 38 ومن النشاط قناة ترب المستمدة من تحليل الضوضاء النار التي تم الحصول عليها من أوماتيديا معزولة 34 . ويفترض أن إجراء تشريح تضررت كثيرا الخلايا مبصرة عند استخدام هذا الأسلوب.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد حظي الجزء التجريبي من هذا البحث بدعم من المنح المقدمة من مؤسسة العلوم الوطنية الأميركية-الإسرائيلية (بم و إيل)، ومؤسسة العلوم الإسرائيلية (إيسف)، و بروجيكتوكوبيراتيون ديوتسش (ديب) (إلى بم)، و بيوتيشنولوغي ومجلس بحوث العلوم البيولوجية (أرقام منحة ببسرك: بب / M007006 / 1 و بب / D007585 / 1) إلى رش
Materials
| 10 ml syringe | |||
| 5 ml syringe | |||
| 1 ml syringe with elongated tip | |||
| Petri dish | 60 mm | ||
| Silicone dissection dish/block | Dow Corning | Sylguard 184 Silicone Elastomer Kit | Throughly mix both components, pour into mould and cure for 2 hours at 60ᵒC |
| Syringe filters | Millex | 22 µm PVDF filter | |
| Capillaries (for omatidia separation) | Glass, 1.2 x 0.68 mm (~7.5 cm each) | ||
| Polyethylene Tubing | Becton Dickinson | 1.57 x 1.14 mm (35 cm) | |
| 2 small beakers | 50 ml or less | ||
| 2 paraffin film sheets | Parafilm M | ~5 x 5 cm | |
| Bath chamber | home made | ||
| Cover slips | 22 x 22 mm No. 0 | ||
| Paraplast Plus | Sigma | Paraffin – polyisobutylene mixture | To glue the coverslip onto the bottom of the bath chamber |
| Ground | Warner Instruments | 64-1288 | Hybrid Assembly Ag-AgCl Wire Assembly |
| Headless micro dissection needle | Entomology, 12 mm | ||
| Micro dissecting needle holder | |||
| Vise | |||
| 2 fine tweezers + 1 rough tweezers | Dumont #5, Biology | 0.05 x 0.02 mm, length 110 mm, Inox | |
| Stereoscopic zoom Microscope | Nikon | SMZ-2B | |
| Cold light source | Schott | KL1500 LCD | |
| Filter (Color) for cold light source | Schott | RG620 | |
| Delicate wipers | Kimtech | Kimwipes | |
| Electrode holder | Warner Instruments | QSW-T10P | Q series Holders compatible with Axon amplifiers, straight body style |
| Silver Wire | Warner Instruments | 0.25 mm diameter, needs to be chloridized | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MP 85 | Huxley-Wall Style Micromanipulator |
| Faraday cage | home made | Electromagnetic noise shielding and black front curtain | |
| Anti-vibration Table | Newport | VW-3036-OPT-01 | |
| Osilloscope | GW | GOS-622G | |
| Perfusion system | Warner Instruments | VC-8P | Pinch valve control system |
| Perfusion valve controller | Scientific instruments | BPS-8 | |
| Suction system | |||
| Amplifier | Molecular Device | Axopatch-1D | |
| Head-stage | Molecular Device | CV – 4 | Gain: x 1/100 |
| A/D converter | Molecular Device | Digidata 1440A | |
| Clampex | Molecular Device | 10 | software |
| pCLAMP | Molecular Device | 10 | software |
| Light source (Xenon Arc lamp) | Sutter Instruments | Lambda LS | |
| Light detector | home made | phototransistor | |
| Filter wheel and shutter controller | Sutter Instruments | Lambda 10-2 with a Uniblitz shutter | |
| Filters (Natural density filter) | Chroma | 6,5,4,3,2,1,0.5,0.3 | |
| Filter (Color) | Schott | OG590, Edge filter | |
| Xenon Flash Lamp system | Dr. Rapp OptoElecftronic | JML-C2 | |
| Light guide | Quartz | ||
| Pulse generator | AMPI | Master 8 | |
| Microscope | Olympus | IX71, Inverted | |
| Red illumination filter (Microscope) | RG630 / RG645 ø45mm | ||
| Microscope objective | Olympus | X60/0.9 UplanFL N air or X60/1.25 UplanFI oil | |
| CCD Camera | Andor | iXon DU885K | |
| NIS Element | Nikon | AR | software |
| Ca+2 indicator | Invitrogen | Calcium green 5N | |
| Excitation & emission filters and dichroic mirror | Chroma | 19002 – AT – GFP/FITC Longpass set | |
| Vertical pipette puller | Narishige | Model PP83 | Use either vertical or horizontal puller, as preferred. |
| Horizontal pipette puller | Sutter Instrument | Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette Puller | |
| Filament | Sutter Instrument | 3 mm trough or square box | |
| Capillaries | Harvard Apparatus | borosilicate glass capillaries | 1 x 0.58 mm |
References
- Hardie, R. C. Whole-cell recordings of the light induced current in dissociated Drosophila photoreceptors: evidence for feedback by calcium permeating the light-sensitive channels. Proc. R. Soc. Lond. B. 245, 203-210 (1991).
- Ranganathan, R., Harris, G. L., Stevens, C. F., Zuker, C. S. A Drosophila mutant defective in extracellular calcium- dependent photoreceptor deactivation and rapid desensitization. Nature. 354, 230-232 (1991).
- Martin, J. H., Benzer, S., Rudnicka, M., Miller, C. A. Calphotin: a Drosophila photoreceptor cell calcium-binding protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (4), 1531-1535 (1993).
- Weiss, S., et al. Compartmentalization and Ca2+ buffering are essential for prevention of light-induced retinal degeneration. J Neurosci. 32 (42), 14696-14708 (2012).
- Wang, T., et al. Light activation, adaptation, and cell survival functions of the Na + /Ca 2+ exchanger CalX. Neuron. 45 (3), 367-378 (2005).
- Weckstrom, M., Hardie, R. C., Laughlin, S. B. Voltage-activated potassium channels in blowfly photoreceptors and their role in light adaptation. J. Physiol. Lond. 440, (1991).
- Frolov, R. V., Immonen, E. V., Weckström, M. Performance of blue- and green-sensitive photoreceptors of the cricket Gryllus bimaculatus. J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 200 (3), 209-219 (2014).
- Nasi, E. Whole-cell clamp of dissociated photoreceptors from the eye of Lima scabra. J Gen Physiol. 97 (1), 35-54 (1991).
- Nasi, E., Gomez, M. P. Light-activated ion channels in solitary photoreceptors of the scallop Pecten irradians. J. Gen. Physiol. 99, 747-769 (1992).
- Hardie, R. C., Peretz, A., Pollock, J. A., Minke, B. Ca 2+ limits the development of the light response in Drosophila photoreceptors. Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 252, 223-229 (1993).
- Kohn, E., et al. Functional Cooperation between the IP3 Receptor and Phospholipase C Secures the High Sensitivity to Light of Drosophila Photoreceptors In Vivo. J Neurosci. 35 (6), 2530-2546 (2015).
- Hevers, W., Hardie, R. C. Serotonin modulates the voltage dependence of delayed rectifier and Shaker potassium channels in Drosophila photoreceptors. Neuron. 14 (4), 845-856 (1995).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Henderson, S. R., Reuss, H., Hardie, R. C. Single photon responses in Drosophila photoreceptors and their regulation by Ca 2. J. Physiol. Lond. 524 (Pt 1), 179-194 (2000).
- Scott, K., Zuker, C. S. Assembly of the Drosophila phototransduction cascade into a signalling complex shapes elementary responses. Nature. 395 (6704), 805-808 (1998).
- Elia, N., Frechter, S., Gedi, Y., Minke, B., Selinger, Z. Excess of G betae over G qalphae in vivo prevents dark, spontaneous activity of Drosophila photoreceptors. J. Cell Biol. 171 (3), 517-526 (2005).
- Katz, B., Minke, B. Phospholipase C-Mediated Suppression of Dark Noise Enables Single-Photon Detection in Drosophila Photoreceptors. J. Neurosci. 32 (8), 2722-2733 (2012).
- Hardie, R. C., et al. Molecular basis of amplification in Drosophila phototransduction. Roles for G protein, phospholipase C, and diacylglycerol kinase. Neuron. 36 (4), 689-701 (2002).
- Reuss, H., Mojet, M. H., Chyb, S., Hardie, R. C. In vivo analysis of the Drosophila light-sensitive channels, TRP and TRPL. Neuron. 19, 1249-1259 (1997).
- Liu, C. H., et al. In vivo identification and manipulation of the Ca 2+ selectivity filter in the Drosophila transient receptor potential channel. J. Neurosci. 27 (3), 604-615 (2007).
- Ahmad, S. T., Natochin, M., Barren, B., Artemyev, N. O., O’Tousa, J. E. Heterologous expression of bovine rhodopsin in Drosophila photoreceptor cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (9), 3722-3728 (2006).
- Scott, K., Sun, Y., Beckingham, K., Zuker, C. S. Calmodulin regulation of Drosophila light-activated channels and receptor function mediates termination of the light response in vivo. Cell. 91 (3), 375-383 (1997).
- Liu, C. H., et al. Ca 2+ -dependent metarhodopsin inactivation mediated by calmodulin and NINAC myosin III. Neuron. 59 (5), 778-789 (2008).
- Cook, B., et al. Phospholipase C and termination of G-protein-mediated signalling in vivo. Nat. Cell Biol. 2 (5), 296-301 (2000).
- Hardie, R. C., Franze, K. Photomechanical responses in Drosophila photoreceptors. Science. 338 (6104), 260-263 (2012).
- Huang, J., et al. Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors. Curr. Biol. 20 (3), 189-197 (2010).
- Minke, B., Wu, C. F., Pak, W. L. Isolation of light-induce response of the central retinular cells from the electroretinogram of Drosophila. J. Comp. Physiol. 98, 345-355 (1975).
- Hardie, R. C., Minke, B. The trp gene is essential for a light-activated Ca2+ channel in Drosophila photoreceptors. Neuron. 8, 643-651 (1992).
- Niemeyer, B. A., Suzuki, E., Scott, K., Jalink, K., Zuker, C. S. The Drosophila light-activated conductance is composed of the two channels TRP and TRPL. Cell. 85 (5), 651-659 (1996).
- Huber, A., et al. The transient receptor potential protein (Trp), a putative store- operated Ca 2+ channel essential for phosphoinositide-mediated photoreception, forms a signaling complex with NorpA, InaC and InaD. EMBO J. 15 (24), 7036-7045 (1996).
- Shieh, B. H., Niemeyer, B. A novel protein encoded by the InaD gene regulates recovery of visual transduction in Drosophila. Neuron. 14 (1), 201-210 (1995).
- Tsunoda, S., et al. A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade. Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).
- Tsacopoulos, M., Veuthey, A. L., Saravelos, S. G., Perrottet, P., Tsoupras, G. Glial cells transform glucose to alanine, which fuels the neurons in the honeybee retina. J. Neurosci. 14 (3 Pt 1), 1339-1351 (1994).
- Hardie, R. C., Minke, B. Spontaneous activation of light-sensitive channels in Drosophila photoreceptors. J. Gen. Physiol. 103, 389-407 (1994).
- Agam, K., et al. Metabolic stress reversibly activates the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL in vivo. J Neurosci. 20 (15), 5748-5755 (2000).
- Agam, K., Frechter, S., Minke, B. Activation of the Drosophila TRP and TRPL channels requires both Ca2+ and protein dephosphorylation. Cell Calcium. 35 (2), 87-105 (2004).
- Delgado, R., Muñoz, Y., Peña-Cortés, H., Giavalisco, P., Bacigalupo, J. Diacylglycerol activates the light-dependent channel TRP in the photosensitive microvilli of Drosophila melanogaster photoreceptors. J Neurosci. 34 (19), 6679-6686 (2014).
- Parnas, M., Katz, B., Minke, B. Open channel block by Ca2+ underlies the voltage dependence of Drosophila TRPL channel. J. Gen. Physiol. 129 (1), 17-28 (2007).
