Aqui, descrevemos uma técnica laparoscópica minimamente invasiva para a amostragem de série do fígado e linfonodos mesentéricos (MLN) em macacos que permite o aumento da frequência de amostragem, e reduz o potencial de complicações cirúrgicas quando comparada a realização de uma laparotomia.
Os linfonodos mesentéricos (MLN) e o fígado são expostos aos micróbios e produtos microbianos a partir do tracto gastrointestinal (GI), tornando-os imunologicamente única. O tracto GI e MLN associado são sítios de replicação viral no início da infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) e o MLN são prováveis locais de reservatórios importantes que abrigam células latentemente infectados, mesmo depois de a terapia anti-retroviral prolongada (ART). O fígado foi mostrado para desempenhar um papel significativo nas respostas imunes de lentivírus e parece desempenhar um papel significativo na depuração do vírus de circulação. primata não humano (NHP) modelos para o HIV e Síndrome de Imunodeficiência Adquirida (SIDA) imitam de perto estes aspectos da infecção por HIV e de amostragem longitudinal série de sítios primários de replicação viral e as respostas imunológicas associadas a este modelo ajudará a elucidar acontecimentos críticos na infecção, patogênese e o impacto de várias estratégias de intervenção sobre estes eventos. Currtécnicas ent publicada a amostra de fígado e MLN juntos envolvem grande cirurgia e / ou necropsia, o que limita a capacidade de investigar estes locais mais importantes de uma forma de série, no mesmo animal. Nós já descreveu uma técnica laparoscópica para coleção de MLN. Aqui, nós descrevemos uma técnica minimamente invasiva laparoscópica para amostragem de série longitudinal de fígado e MLN através dos mesmos dois locais de porta necessários para a recolha de MLN. O uso das mesmas duas portas minimiza o impacto para os animais como não há necessidade de incisões adicionais. Esta técnica pode ser utilizada com o aumento da frequência de amostragem comparada com a grande cirurgia abdominal e reduz o potencial para complicações cirúrgicas e associado respostas inflamatórias locais e sistémicas que poderia complicar a interpretação dos resultados. Este procedimento tem o potencial para facilitar estudos envolvendo modelos NHP, melhorando o bem-estar animal.
O tracto gastrintestinal (GI) é a maior superfície da mucosa do corpo e é exposto a uma variedade de antigénios derivados de agentes patogénicos, e comunidades bacterianas endossimbióticas vulgarmente referido como o microbiome 1, 2. Os nódulos linfáticos mesentéricos (MLN) alinham o tracto GI e são um sítio principal da função imunitária para promoção de respostas inflamatórias ou tolerogénicos para estes antigénios diferentes. A organização física do MLN cria um sistema compartimentado que possa responder aos antígenos localmente sem obter respostas sistêmicas 3. Da mesma forma, o sangue dos drenos do tracto GI para o fígado através da veia porta antes de voltar para a circulação, e é, portanto, expostas a micróbios e produtos microbianos que translocados a partir do tracto GI para a lâmina própria e entrou na corrente sanguínea 4. O fígado funciona também como um órgão linfóide secundário umND tem um grande número de células do sistema imunológico, incluindo macrófagos especializados, para remover micróbios translocados 5, 6. Assim, a MLN e o fígado são os órgãos imunes primárias expostas a comensais e patogénicos bactérias do trato GI, bem como o meio de antigénios a partir de outras fontes, o que os torna única e importante do ponto de vista imunológico.
O MLN são locais críticos para a avaliação dos efeitos virológicos e imunológicos de vírus da imunodeficiência humana (HIV) ou infecção patogénica do vírus da imunodeficiência símia (SIV), e estão provavelmente envolvidos na disseminação precoce de SIV seguinte desafio intra-rectal. Tecido linfóide associado aos intestinos é conhecido por ser um dos principais locais da replicação do HIV persistente, apesar do controlo eficaz da viremia por terapias anti-retrovirais modernos (ART) 7. Em modelos de infecção com SIV, MLN foram mostrados para ser reservatórios importantes de vírus latente e podeser o principal reservatório 8, 9. O fígado é também importante na infecção de lentivírus, como é evidenciado pela acumulação de células T CD8 + específicas de SIV nos fígados de macacos durante a infecção por VIS aguda 10. Além disso, é o principal órgão responsável por limpar o vírus de circulação 11.
HIV e infecção por SIV são associados com microbiota GI alterada, interrompida a integridade do epitélio GI, e aumentou a translocação de micróbios e produtos microbianos a partir do cólon para a periferia e circulação 12, 13. Estes processos estão associados com a activação imunitária local e sistémica, e o aumento da morbidade e mortalidade em indivíduos infectados pelo HIV 14. Na infecção por SIV, bactérias translocados foram observados no MLN 15, enquanto que a acumulação de microfoneprodutos robial no fígado foi mostrado resultar em inflamação e danos no órgão 16. Assim, no contexto do HIV e infecções SIV, a MLN e no fígado pode ser altamente informativa para a compreensão dos processos inflamatórios accionados por bactérias GI-residente.
Aqui, nós apresentamos uma técnica minimamente invasiva laparoscópica para amostragem em série da MLN e fígado em primatas não humanos (PNH). Nós demonstramos desempenho bem sucedido desta técnica em dois macacos rhesus fêmea saudáveis (valor eficaz), amostragem cada animal duas vezes, com 160 dias entre cada cirurgia. Nós continuamos a usar estas amostras para avaliar e comparar as principais populações de leucócitos e linfócitos no interior de cada órgão utilizando citometria de fluxo, e demonstram dados altamente consistentes entre os dois pontos de tempo.
Aqui, nós demonstramos uma técnica minimamente invasiva para a coleta de série do MLN e biópsias hepáticas que teve uma taxa de sucesso de 100% nesses e em outros animais não descritos neste estudo. Além disso, o uso desta técnica nos mesmos animais através do tempo não tem sido associada com eventos adversos. Com efeito, não houve complicações resultantes da utilização desta técnica em outros grupos de animais que foram infectados com SIV, simian / vírus da imunodeficiência humana (SHIV), ou vírus Zika (dados não publicados). Da mesma forma, esta cirurgia tem sido bem sucedida, mesmo em animais que tinham anteriormente sido submetidos a cirurgia abdominal de grande porte, e em animais trombocitopenia (dados não publicados). Demonstrou-se que estas amostras podem ser recolhidas através das mesmas duas portas através da inversão da localização da câmara quando se muda de MLN de fígado evitando a necessidade de incisões adicionais. Fatores que afetam a coleção de MLN foram anteriormente relatados 13.
<pclass = "jove_content"> Até quatro coleções de 3 MLN e 3 biópsias hepáticas cada foram realizados através do tempo em animais específicos, sem complicações, mudanças nas taxas de sucesso, ou alterações para os dados coletados. Além disso, esta técnica de recolha / fígado MLN laparoscópica foi combinada com êxito com outros processos, tais como a recolha de LNs periféricas, endoscópicos biópsias do tracto GI superior e inferior, aspirado de medula óssea, a recolha de fluido cerebrospinal, e punção venosa no mesmo evento anestésico permitindo a análise extensiva virológica e respostas imunológicas em série (dados não publicados).Todo o processo demora tipicamente 30 – 45 min para completar e é realizada através de duas incisões ~ 0,5 cm. Em animais obesos, pode ser necessário fazer uma incisão maior (~ 1-1,5 cm) para recuperar MLN através e pode necessitar de tempo adicional para completar. Animais com extensa gordura mesentérica muitas vezes exigem experiência significativa para differentiate MLN da gordura envolvente. MLN são freqüentemente encontrados ao longo da vasculatura mesentérica e parecem ser mais prevalente perto de pontos de ramificação dos vasos. Um aspecto fundamental desta técnica é que ele exige a MLN seleccionado para ter mobilidade suficiente no mesentério para ser exteriorizado através da incisão abdominal. Como resultado, esta técnica não pode ser utilizada para recolher MLN perto da raiz do mesentério. Devido à ampliação, às vezes é mais fácil identificar MLN com a câmera, e agarrando em estreita proximidade com o MLN pode ajudar com localizar e identificar o nó uma vez que é exteriorizado.
Uso da posição Trendelenburg nem sempre pode ser necessário para a coleta MLN, e se MLN pode ser facilmente recuperado sem o uso de posição Trendelenburg pode fazer biópsias hepáticas mais fácil uma vez que irá impedir que os órgãos de deslocamento cranial. Às vezes, após a colocação em posição de Trendelenburg, o fígado é deslocado para cima contra o diafragma e obrigação ser cuidadosamente manipulada volta para a posição antes da recolha de biópsia. Como a colocação da porta para a recolha MLN é para a esquerda, biópsias hepáticas são normalmente tomadas a partir dos lobos hepáticos mediais e laterais esquerda, à medida que estão mais próximos da cânula.
Recolhido MLN e biópsias hepáticas fornecida amplas rendimentos de células para uma variedade de análises a jusante e mostrou uma alta viabilidade das células colhidas. Aqui, as células foram coradas para anise de citometria de fluxo das populações de leucócitos e linfócitos, e as principais diferenças entre estes dois órgãos imunes importantes foram elucidados. Por exemplo, o MLN foram altamente enriquecidas em células T CD4 + em comparação com o fígado, devido à importância da MLN como pontos centrais para recolha e de difusão respostas imunes adaptativas, bem como para a importância das células CD4 + T para gerir inflamatória e respostas tolerogénicas ao meio antigénios derivados de consumo alimentar e microrganismos GI-residentes = "xref"> 24. No entanto, o fígado foi significativamente enriquecida para células CD14 + leucócitos em comparação com o MLN. CD14 é expresso predominantemente em monócitos e macrófagos e é um componente essencial do complexo de receptor para o lipopolissacarídeo bacteriano (LPS) 25. Na verdade, concentrações plasmáticas aumentadas de CD14 solúvel está associado com a translocação microbiana e activação imunitária em HIV e SIV infecções patogénicas 26. Assim, as frequências mais elevadas de leucócitos CD14 + no fígado provavelmente o resultado de uma maior carga bacteriana neste órgão quando comparado com o MLN.
Aqui, nós demonstramos uma técnica cirúrgica rápida e minimamente invasivo para coleta de série do MLN e biópsias hepáticas usando apenas duas pequenas incisões para a entrada laparoscópica que não levou a quaisquer resultados adversos. Estas amostras de fornecer um percurso útil para avaliar os processos de chave imunológica, virológicos e microbiológicos que levam place no MLN e fígado, que são separados e original de imunidade sistémica. Da mesma forma, as biópsias de fígado são críticas para a avaliação a longo prazo dos efeitos do HIV / SIV, drogas terapêuticas, e os micróbios translocados, que muitas vezes se combinam para induzir lesão hepática significativa 16. Além disso, porque o MLN e fígado são órgãos imunes expostos a GI microbiota, a capacidade de avaliar a imunidade nesses órgãos ao longo do tempo fornece uma excelente plataforma para a compreensão do papel que o microbioma desempenha na manutenção do host homeostase imunológica. Tomados em conjunto, a avaliação do fígado e MLN é de grande importância no contexto de vacinas e eficácias terapêuticas, a depuração viral reservatório SIV, e imunidade mucosa em geral. A capacidade de recolher estas amostras através de uma abordagem minimamente invasiva significa que há menos risco de inflamação relacionada com o procedimento do que existe com as técnicas actualmente publicados e menos impacto sobre a fisiologia do animal. No future, iremos avaliar o potencial de combinar a coleção de MLN e fígado com a coleção de baço através dos mesmos dois locais de porta para permitir amostragem de outra parte importante e distinta do sistema imunitário que tem sido mostrado para jogar um papel significativo na uma série de modelos de doenças.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado pelo NIH número de concessão P51OD010425.
Artficial Tears Lubricant Ophthalmic Ointment | Patterson Veterinary | 97-890-8152 | |
Priority Care Chlorhexidine 2% Scrub | Patterson Veterinary | 07-842-6153 | |
Vedco Alcohol, Isopropyl 70% | Patterson Veterinary | 07-869-6434 | |
Vedco Vetadine Scrub | Patterson Veterinary | 07-869-6772 | |
Hospira Lactated Ringer's 250 ml | Patterson Veterinary | 07-800-9325 | |
Adolescent Laparotomy Surgical Drape | Medline | DYNJP3004 | |
Access 40 L Insufflator | Dyonics | 7205832 | |
300XL Xenon Light Source | Dyonics | 7206084 | |
460P 3 – CCD Digital Camera with Head | Dyonics | 72200086 | |
Universal Camera Drape, 7” x 96” | Endoscopy Support Services | ESS-6920 | |
Universal Light Guide, 7.5 Ft | Endoscopy Support Services | US.OU225 | |
Insufflator Tubing | Endoscopy Support Services | TM-102 | |
Multipurpose Rigid Scope, 2.7mm x 187.5mm, 0 degree | Endoscopy Support Services | B30-0007-00 | |
Exam and Protective Sheath for 2.7mm x 187.5mm scope with one fixed stopcock | Endoscopy Support Services | B10-0025-00 | |
Rigid scope, 5mm x 300mm | Endoscopy Support Services | B30-0071-00 | |
Veress Needle, 2mm x 80mm | Endoscopy Support Services | 8302.08 | |
Solid Probe with Markings, 5mm x 320mm | Endoscopy Support Services | 8383.661 | |
Maryland Grasping and Dissecting Forceps with Double Action Ratchet Handle, 3.5mm x 240mm | Endoscopy Support Services | 8390.2054 | |
Biopsy Forceps, 3.5mm X 310mm | R. Wolf | 8391.4063 | |
Plastic Threaded Cannula with Insufflator Port, 3.5mm x 60mm | Endoscopy Support Services | 8903.072 | |
Plastic Threaded Cannula with Insufflator Port, 5.5mm x 60mm | Endoscopy Support Services | 8919.333 | |
Blunt Tip Trocar | Endoscopy Support Services | 8903.101 | |
Pyramidal Tip Trocar | Endoscopy Support Services | 8903.121 | |
CO2 | Airgas | CD USPE | |
RPMI 1640 | Fisher Scientific | SH30027FS | with L-Glutamine |
RNAlater Stabilization Solution | ThermoFisher Scientific | AM7021 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
Liberase TM Research Grade | Sigma Aldrich | 5401119001 | Commercially available colleganse solution |
Dnase I from bovine pancrease | Sigma Aldrich | D5025 | |
70 µm cell strainers | Morganville Scientific | CSS0200 | |
5mL Syringe | BD | 309646 | |
50mL Conical Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339652 | |
Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3007003 | |
5mL Round-Bottom polystyrene tubes | Fisher Scientific | 14-959A | |
PBS | Fisher Scientific | SH3025601 | |
LIVE/DEAD Aqua Fixable Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher Scientific | L34957 | Amine dead cell stain |
CD45-PerCP (clone D058-1283) | BD Biosciences | 558411 | |
PE-CF594 Mouse anti-Hu CD3 (clone SP34-2) | BD Biosciences | 562406 | |
BV605 Mouse Anti-Hu CD4 (clone OKT4) | Biolegend | 317438 | |
APC-H7 Mouse anti-Hu CD8 (clone SK1) | BD Biosciences | 560179 | |
PE-Cy5 Mouse Anti-Hu CD20 (clone 2H7) | BD Biosciences | 555624 | |
BV786 Mouse Anti-Hu CD14 (clone M5E2) | BD Biosciences | 563698 | |
16% PARAFORMALDEHYDE AQ SOLUTN | Fisher Scientific | 50-980-487 | |
LSR II Flow Cytometer | BD | NA |