Identification des protéines végétales se liant à glace par l'évaluation de l'inhibition de recristallisation de glace et isolement utilisant purification Ice-affinité

Des protéines de liaison glace (IBP) sont une famille diversifiée de protéines protectrices qui ont été découvertes dans un certain nombre d'organismes , y compris les plantes, les insectes ^{1 2 3,} les poissons et les microbes ^4. La principale caractéristique de ces protéines est leur capacité unique à adsorber spécifiquement et efficacement aux cristaux de glace, modifiant leur croissance. IBP possède plusieurs propriétés documentées, avec les deux plus bien caractérisés étant hystérésis thermique (TH) et l'inhibition de la recristallisation de la glace (IRI). l'activité TH est plus facilement observée dans IBP chez les animaux de gel intolérants. Cette activité se traduit par abaissement du point de congélation des fluides circulatoires ou interstitiel organismes pour éviter le gel. En revanche, dans les organismes de gel tolérant, qui inévitablement geler à des températures inférieures à zéro, IBP semblent avoir une activité faible TH. En dépit de la faible activité TH, une forte activité IRI pour limiter le cri de la glacela croissance Stal est souvent observée avec ces protéines. Pour l'organisme tolérant le gel, cette activité IRI permet vraisemblablement de protéger les cellules de la croissance incontrôlée de la glace dans les compartiments extracellulaires.

Le modèle « bouton de matelas » peut être utilisé pour décrire le mécanisme par lequel IBP prévenir la croissance des cristaux de glace ^5. Selon ce modèle, IBP adsorber spécifiquement à la surface des cristaux de glace à des intervalles, de telle sorte que les molécules d'eau ne peuvent incorporer avec le réseau cristallin de la glace de plus en plus dans l'espace entre IBP lié. Cela crée une courbure qui rend l'incorporation de molécules d'eau supplémentaires défavorables, un événement qui peut être décrit par l'effet Gibbs-Thomson ^6. L'hypothèse ancrée de l'eau de clathrate fournit un mécanisme pour la liaison spécifique de IBP à la surface des cristaux de glace de sorte que la présence de résidus chargés, en particulier placés sur le site de liaison de protéine de la glace, les résultats dans le reorganism des molécules d'eau afin qu'ils correspondent à un ou plusieurs plans du réseau cristallin de la glace ^7.

activité TH peut être quantifiée en mesurant la différence entre les températures de fusion et de congélation d'un seul cristal de glace en présence d'un IBP. Bien que l'activité TH est une méthode d'évaluation de l'activité de IBP, le faible écart de TH largement acceptée produite par l'usine IBP (typiquement seulement une fraction d'un degré) exige normalement une concentration élevée en protéines, un équipement spécialisé et de l'expérience de l'opérateur. Bien que non-IBP peut limiter la croissance des cristaux de glace, il est une propriété partagée par tous IBP et tester ainsi l'activité IRI est un écran initial efficace pour la présence de IBP, en particulier pour ceux qui ont une faible activité TH. La méthode utilisée pour tester cette activité est connu comme un « essai de floc », par lequel un échantillon de protéine est éclair congelée pour produire une monocouche de petits cristaux de glace, qui sont observées sur une période de temps pour déterminer sila croissance des cristaux de glace est limité. Contrairement à d'autres méthodes utilisées pour cribler un échantillon de tissu source pour la présence d'IBP, cette technique est applicable à de faibles concentrations de protéines dans l'intervalle de 10 à 100 ng, utilise un équipement facilement fabriqué, et génère des données qui sont rapidement et facilement interprétée. Cependant, il est important de souligner que cette analyse fournit un écran initial pour IBP qui devrait être suivi par la détermination de la TH et mise en forme de cristaux de glace.

L'isolement des protéines natives est difficile, ce qui nécessite souvent des informations sur les propriétés structurales et biochimiques d'une protéine d'intérêt. L'affinité des IBP pour la glace permet l'isolement de ces protéines en utilisant de la glace en tant que substrat à des fins de purification. Etant donné que la majorité des molécules sont poussés en avant de la limite de l'eau glacée pendant la croissance des cristaux de glace, la croissance lente d'une hémisphère de la glace en présence d'un échantillon des résultats d'IBP dans un échantillon hautement purifié, exempt de grande quantits de protéines contaminantes et des solutés. Cette méthode a été utilisée pour identifier des insectes IBP ^{8, 9, 10, 11} les bactéries, les poissons et les plantes ^{12 13, 14.} En outre, les fractions enrichies en IBP obtenus par ce procédé peuvent également être utilisés pour l'analyse biochimique en aval. Le présent document décrit l'identification de IBP dans les plantes par l'induction et l'extraction de IBP, l'analyse de l'activité IRI pour confirmer la présence de protéines, et l'isolement des protéines en utilisant une purification par affinité de la glace.