System för Efficacy och cytotoxicitet Screening av inhibitorer Inriktning Intracellulär<em> Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, det medel som förorsakar tuberkulos (TB), är en ledande orsak till morbiditet och mortalitet över hela världen. Läkemedelskänslig TB är en behandlingsbar sjukdom som kräver flera antibiotika för en period av 6 månader. Trots att en behandlingsbar sjukdom, var TB dödligheten uppskattas till 1,5 miljoner 2015 ^1. Under de senaste 10 åren har det ökat oron över förekomsten av läkemedelsresistent M. tuberculosis. Multiresistent TB (MDR-TB) definieras som TB som är resistent mot åtminstone Isoniazid (INH) och Rifampicin (RMP), och de flesta MDR-TB stammar är också resistenta mot välja andra linjens TB-droger, vilket begränsar behandlingsalternativen . Effekterna av läkemedelsresistens skapa en större utmaning för behandling av patienter som samtidigt är infekterade med humant immunbristvirus (HIV); 400.000 patienter över hela världen dött av HIV-associerad TB 2015 ^1. Beklagansvärt, USA Food and Drug Administranson har godkänt endast en ny TB läkemedel mot MDR-TB, bedaquiline, under de senaste 40 åren ^2. Framsteg i att hitta bättre och kortare TB terapier finns ett trängande behov för att ligga steget före i kampen mot tuberkulos och MDR-TB.

Traditionellt är TB drogskärmar utföras under in vitro odlingsbetingelser i tillväxtmedium, varvid föreningarna tillsätts till en växande kultur och deras effektivitet i att utrota mikroorganismerna bestäms genom att räkna kolonibildande enheter (CFU) på fast medium. Eftersom CFU räknas är arbetskrävande, tidskrävande och kostsamt, har olika indirekta metoder utvecklats för att lindra detta problem. Sådana metoder innefattar viabilitetsanalys den Alamar Blue ^3, bestämningen av fluorescens ⁴ från grönt fluorescerande protein (GFP) eller luminescens ⁵ från luciferas-uttryckande bakterier, och uppskattningen av total adenosintrifosfat (ATP) ^{6, 7.}

Typisk TB kännetecknas av en tuberkulos infektion i lungan, där bakterierna vistas och replikera inuti fagosomer av alveolära makrofager ⁸ M.. Den enkla in-buljong fenotypisk skärmen kan passa extracellulära patogener; emellertid, i historiskt perspektiv, slog föreningar mot M. tuberculosis identifierades med användning av denna metod misslyckas ofta med att leva upp till förväntningarna under nedströmsvalideringssteg i infektionsmodeller. Vi föreslår att TB läkemedel utförs bäst i en intracellulär värdcell infektion modell. Ändå intracellulära modeller har många tekniska och biologiska hinder för high-throughput screening (HTS) utveckling. Ett stort hinder är komplexiteten i infektionsprocessen, exemplifieras av ett stort antal steg och genomarbetade avlägsnande av extracellulära bakterier genom in-mellan tvätt. En andra stora hindret är den långa tid requirements, som tillväxtdetektering, normalt genom CFU räknar med odlingsplattor, är en process som tar över tre veckor att slutföra. En lösning för att ersätta CFU counts har tillhandahållits av automatiserad fluorescerande mikroskopi i kombination med fluorescerande bakterier. Detta förutsätter dock lösning en initial investeringar i utrustning som är utom räckhåll för många forskningslaboratorier. En enkel, billig, och sjukdomsrelevanta HTS metod skulle i hög grad öka läkemedelsupptäcktsprocessen.

I denna studie rapporterar vi en ny, modulärt HTS-system som syftar till att ge en snabb och mycket skalbar, men ekonomiska, analys lämplig för bestämning av aktiviteten hos föreningarna mot intracellulär M. tuberculosis. Detta system består av tre moduler: (i) intracellulära, (ii) cytotoxicitet, och (iii) i-buljong analyser. Den kombinerade slutresultatet ger en omfattande beskrivning av de sammansatta egenskaper, med ytterligare information beträffande den potentiella verkningsmekanism. denna screening systemet har använts i flera projekt med olika föreningsbibliotek som är inriktade verkningsmekanism, inklusive analys av läkemedels synergi ^9, stimulering av autophagy ^10, och inhiberingen av M. tuberculosis -secreted virulensfaktor (opublicerad). Föreningar av okänd verkningsmekanism har också studerats ^11. En modifierad version av denna metod antogs också av vår industriell partner som den primära screeningmetod för att identifiera nya föreningar mot intracellulär M. tuberculosis ^11.