Система для эффективности и цитотоксичности скрининга ингибиторов Таргетинг внутриклеточных<em> Микобактерии туберкулеза</em
Summary
Мы разработали модульную систему скрининга с высокой пропускной способностью для обнаружения новых соединений в отношении микобактерий туберкулеза, нацеливание внутриклеточных и в-бульоне растущих бактерий, а также цитотоксичность против клетки – хозяина млекопитающего.
Abstract
Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.
Introduction
Микобактерии туберкулеза, возбудитель туберкулеза (ТБ), является ведущей причиной заболеваемости и смертности во всем мире. Drug-чувствительный туберкулез поддается лечение заболевания, которое требует несколько антибиотиков на срок от 6 месяцев. Несмотря на то , поддающееся лечению заболевание, смертность от туберкулеза, по оценкам, 1,5 миллиона в 2015 году 1. За последние 10 лет, увеличивались озабоченность по поводу распространенности лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза. С множественной лекарственной устойчивостью туберкулеза (МЛУ-ТБ) определяется как туберкулез, который устойчив к по меньшей мере, к изониазиду (изониазид) и рифампицин (РМП), а большинство штаммов МЛУ-ТБ также устойчивы, чтобы выбрать препараты второго ряда ТБ, ограничивая тем самым возможности лечения , Последствия лекарственной устойчивости создают большую проблему для лечения пациентов с сочетанной инфекцией вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ); 400000 пациентов по всему миру умерли от ВИЧ-ассоциированного туберкулеза в 2015 году 1. Disappointingly, пищевых продуктов и медикаментов США AdministРацион одобрил только один новый препарат против туберкулеза с МЛУ-ТБ, bedaquiline, в течение последних 40 лет 2. Прогресс в поиске более и более короткие терапии ТБ крайне необходимы для того, чтобы оставаться впереди в борьбе с ТБ и МЛУ-ТБ.
Традиционно, экраны наркотиков ТБ проводят в условиях , в пробирке роста в среде для роста, в результате чего соединения добавляют к растущей культуре , и их эффективность в уничтожении микроорганизмов , которые определяются путем подсчета колониеобразующих единиц (КОЕ) на твердой среде. Как КОИ отсчеты трудоемкие, занимает много времени, и дорого, различные косвенные методы были разработаны для решения этой проблемы. Такие способы включают в себя жизнеспособность анализа Alamar Blue 3, определение флуоресценции 4 из зеленого флуоресцентного белка (GFP) или люминесценции 5 из люциферазы-экспрессирующих бактерий, а также оценку общего аденозинтрифосфата (AТП) 6, 7.
Типичный ТБ характеризуются туберкулезной инфекцией M. легкого, где бактерии проживают и реплицировать внутри фагосом альвеолярных макрофагов 8. Простой экран фенотипического в бульоне может удовлетворить внеклеточные патогены; Однако, в исторической перспективе, ударил соединение против микобактерий туберкулеза , идентифицированное с помощью этого метода часто не оправдали ожидания во время последующих этапов проверки в моделях инфекции. Мы полагаем, что препарат ТБ лучше всего проводить в внутриклеточной модели инфекции клетки-хозяина. Тем не менее, внутриклеточные модели обладают многими технологическими и биологическими барьерами для скрининга (HTS) развития с высокими пропускной способностью. Большое препятствие является сложность инфекционного процесса, на примере многочисленных этапов и сложного удаления внеклеточных бактерий в промежутке между стиркой. Второе основное препятствие является длительным время повторноquirements, как обнаружение роста, обычно проводимой КОЕ в расчете на культуральных планшетах, это процесс, который занимает более 3 недель, чтобы закончить. Одно решение для замены счетчиков КОИХ было обеспечено автоматизированной флуоресцентной микроскопией в сочетании с люминесцентными бактериями. Однако это решение требует первоначальных инвестиций оборудования, которое вне досягаемости для многих научно-исследовательских лабораторий. Простой, недорогой и болезни соответствующего метода HTS бы значительно улучшить процесс обнаружения наркотиков.
В этом исследовании мы сообщаем о новой, модульной системе HTS, которая направлена на обеспечение быстрого и высоко масштабируемый, экономичный, анализа , пригодный для определения активности соединений против внутриклеточных микобактерий туберкулеза. Эта система состоит из трех модулей: (я) внутриклеточных, (II) цитотоксичность, и (III) в бульоне-анализах. В сочетании конечный результат обеспечивает полное описание составных свойств, с дополнительной информацией как с потенциальным механизмом действия. Это СБНreening системы были использовано в нескольких проектах с различными библиотеками соединений , которые способом действия цели, включая анализ наркотики синергии 9, стимуляция аутофагии 10, а также ингибирование микобактерий туберкулеза -secreted фактор вирулентности (неопубликованный). Соединения неизвестного способа действия также были изучены 11. Модифицированная версия этого метода была также принята нашим промышленным партнером в качестве основного метода скрининга для выявления новых соединений против внутриклеточных микобактерий туберкулеза 11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Цель данного исследования состояла в том, чтобы создать простой и экономически эффективный метод HTS с использованием человеческой внутриклеточной модели инфекции для микобактерий туберкулеза. Туберкулез является человек заболевание , характеризующееся инфекции альвеолярных м?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by BC Lung Association and Mitacs.
Materials
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R5886 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | |
| Middlebrook 7H9 | Becton, Dickinson and Company | 271210 | |
| Tween80 | Fisher Scientific | T164 | |
| Albumin, Bovine pH7 | Affymetrix | 10857 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | BP350 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358 | |
| kanamycin sulfate | Fisher Scientific | BP906 | |
| PMA | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| N,N-Dimethylformamide (DMF) | Fisher Scientific | D131 | |
| 1M Hydrocholoric acid (HCl) | Fisher Scientific | 351279212 | |
| Acetic acid | Fisher Scientific | 351269 | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166 | |
| Resazurin | Alfa Aesar | B21187 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229 | |
| THP-1 | American Type Culture Collection | TIB-202 | |
| M. tuberculosis H37Rv | |||
| 96-well flat bottom white plate | Corning | 3917 | |
| 95-well flat bottom clear plate | Corning | 3595 | |
| Transparent plate sealer | Thermo Fisher Scientific | AB-0580 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Biomate 3 | |
| Microplate spectrophotometer | Biotek | Epoch | |
| luminometer | Applied Biosystems | Tropix TR717 |
References
- WHO. . Global tuberculosis report 2015. , (2016).
- Yajko, D. M., et al. Colorimetric method for determining MICs of antimicrobial agents for Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol. 33, 2324-2327 (1995).
- Khare, G., Kumar, P., Tyagi, A. K. Whole-cell screening-based identification of inhibitors against the intraphagosomal survival of Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 57, 6372-6377 (2013).
- Andreu, N., Fletcher, T., Krishnan, N., Wiles, S., Robertson, B. D. Rapid measurement of antituberculosis drug activity in vitro and in macrophages using bioluminescence. J Antimicrob Chemother. 67, 404-414 (2012).
- Mak, P. A., et al. A high-throughput screen to identify inhibitors of ATP homeostasis in non-replicating Mycobacterium tuberculosis. ACS Chem Biol. 7, 1190-1197 (2012).
- Pethe, K., et al. A chemical genetic screen in Mycobacterium tuberculosis identifies carbon-source-dependent growth inhibitors devoid of in vivo efficacy. Nat Commun. 1, 57 (2010).
- Hmama, Z., Pena-Diaz, S., Joseph, S., Av-Gay, Y. Immunoevasion and immunosuppression of the macrophage by Mycobacterium tuberculosis. Immunol Rev. 264, 220-232 (2015).
- Ramon-Garcia, S., et al. Synergistic drug combinations for tuberculosis therapy identified by a novel high-throughput screen. Antimicrob Agents Chemother. 55, 3861-3869 (2011).
- Lam, K. K., et al. Nitazoxanide stimulates autophagy and inhibits mTORC1 signaling and intracellular proliferation of Mycobacterium tuberculosis. PLoS Pathog. 8, e1002691 (2012).
- Sorrentino, F., et al. Development of an Intracellular Screen for New Compounds Able To Inhibit Mycobacterium tuberculosis Growth in Human Macrophages. Antimicrob Agents Chemother. 60, 640-645 (2015).
- Sun, J., et al. A broad-range of recombination cloning vectors in mycobacteria. Plasmid. 62, 158-165 (2009).
- . THP-1 (ATCC TIB-202) Available from: https://www.atcc.org/products/all/TIB-202.aspx (2016)
- Hansen, M. B., Nielsen, S. E., Berg, K. Re-examination and further development of a precise and rapid dye method for measuring cell growth/cell kill. J Immunol Methods. 119, 203-210 (1989).
- Invitrogen. . AlamarBlue assay. , (2008).
- . Handbook of anti-tuberculosis agents. Introduction. Tuberculosis (Edinb). 88 (2), 85-86 (2008).
- Riss, T. L., et al. . Cell Viability Assays. , (2004).
- Meyer, M., et al. In vivo efficacy of apramycin in murine infection models. Antimicrob Agents Chemother. 58, 6938-6941 (2014).
- Ballell, L., et al. Fueling open-source drug discovery: 177 small-molecule leads against tuberculosis. ChemMedChem. 8, 313-321 (2013).
- Grundner, C., Cox, J. S., Alber, T. Protein tyrosine phosphatase PtpA is not required for Mycobacterium tuberculosis growth in mice. FEMS Microbiol Lett. 287, 181-184 (2008).
- Wong, D., Bach, H., Sun, J., Hmama, Z., Av-Gay, Y. Mycobacterium tuberculosis protein tyrosine phosphatase (PtpA) excludes host vacuolar-H+-ATPase to inhibit phagosome acidification. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 19371-19376 (2011).
- Bach, H., Papavinasasundaram, K. G., Wong, D., Hmama, Z., Av-Gay, Y. Mycobacterium tuberculosis virulence is mediated by PtpA dephosphorylation of human vacuolar protein sorting 33B. Cell Host Microbe. 3, 316-322 (2008).
- Chanput, W., Peters, V., Wichers, H. . The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models. , 147-159 (2015).
- Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. J Vis Exp. , e51960 (2014).
- Ferguson, J. S., Weis, J. J., Martin, J. L., Schlesinger, L. S. Complement protein C3 binding to Mycobacterium tuberculosis is initiated by the classical pathway in human bronchoalveolar lavage fluid. Infect Immun. 72, 2564-2573 (2004).
- Andreu, N., et al. Optimisation of bioluminescent reporters for use with mycobacteria. PLoS One. 5, e10777 (2010).
- Queval, C. J., et al. A microscopic phenotypic assay for the quantification of intracellular mycobacteria adapted for high-throughput/high-content screening. J Vis Exp. , e51114 (2014).
- Christophe, T., et al. High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2′ epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors. PLoS Pathog. 5, e1000645 (2009).
- Pethe, K., et al. Discovery of Q203, a potent clinical candidate for the treatment of tuberculosis. Nat Med. 19, 1157-1160 (2013).
