Summary

Sistema de Eficácia e citotoxicidade Rastreio de inibidores Segmentação intracelular<em> Mycobacterium tuberculosis</em

Published: April 05, 2017
doi:

Summary

Nós desenvolvemos um sistema de rastreio de alto rendimento modular para descobrir novos compostos contra o Mycobacterium tuberculosis, direccionamento intracelular e em caldo de crescimento de bactérias, bem como a citotoxicidade contra a célula hospedeira de mamífero.

Abstract

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

Introduction

Mycobacterium tuberculosis, o agente causador da tuberculose (TB), é uma das principais causas de morbilidade e mortalidade em todo o mundo. TB sensível a drogas é uma doença tratável que requer múltiplos antibióticos durante um período de 6 meses. Apesar de ser uma doença tratável da taxa de mortalidade foi estimada em 1,5 milhões em 2015 um. Nos últimos 10 anos, tem vindo a aumentar as preocupações com a prevalência de fármaco-resistentes de M. tuberculosis. Multirresistente tuberculose (TB-MR) é definida como a tuberculose que é resistente a pelo menos isoniazida (INH) e Rifampicina (RMP), e a maioria das estirpes de MDR-TB são também resistentes para seleccionar fármacos para a tuberculose de segunda linha, o que limita as opções de tratamento . Os efeitos da resistência à droga criar um maior desafio para o tratamento de pacientes co-infectados com o Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV); 400.000 doentes em todo o mundo morreu de tuberculose associada ao HIV em 2015 um. Lamentavelmente, os Estados Unidos Food and Drug Administração aprovou apenas uma nova droga TB contra a MDR-TB, bedaquilina, nos últimos 40 anos 2. Avanços em encontrar melhores e mais curtas terapias de tuberculose são urgentemente necessários, a fim de permanecer à frente na luta contra a TB e MDR-TB.

Tradicionalmente, as telas de drogas de TB são realizadas sob condições de crescimento in vitro em meio de crescimento, através do qual os compostos são adicionados a uma cultura em crescimento e a sua eficácia na erradicação dos microrganismos são determinadas pela contagem de unidades formadoras de colónias (CFU) em meio sólido. Como contagens de UFC é trabalho intensivo, demorado, e caro, vários métodos indiretos foram desenvolvidos para aliviar este problema. Tais métodos incluem o ensaio de viabilidade Alamar Blue 3, a determinação da fluorescência a partir de 4 proteína verde fluorescente (GFP) ou luminescência 5 a partir de bactérias que expressam luciferase, e a estimativa do trifosfato de adenosina total de (ATP) 6, 7.

TB típica é caracterizada por uma infecção de M. tuberculosis do pulmão, onde residem as bactérias e replicar no interior das fagossomas de macrófagos alveolares 8. A tela fenotípica simples no caldo pode atender patógenos extracelulares; no entanto, na perspectiva histórica, bateu compostos contra M. tuberculosis identificados usando este método muitas vezes não conseguem corresponder às expectativas durante as etapas de validação de transformação em modelos de infecção. Propomos que a droga TB é melhor executada em um modelo de infecção da célula hospedeira intracelular. No entanto, os modelos intracelulares possuem muitos obstáculos tecnológicos e biológicos para triagem (HTS) desenvolvimento de alto rendimento. Um grande obstáculo é a complexidade do processo de infecção, exemplificado por numerosos passos e a remoção de bactérias extracelulares elaborada por no meio de lavagem. Um segundo grande obstáculo é o longo tempo de requirements, como a detecção de crescimento, normalmente feito por contagem de CFU nas placas de cultura, é um processo que demora mais de 3 semanas para completar. Uma solução para substituir contagens de UFC foi fornecida por microscopia fluorescente automatizada em combinação com bactérias fluorescentes. No entanto, esta solução requer um investimento inicial equipamento que está fora do alcance de muitos laboratórios de pesquisa. Uma simples, de baixo custo, e método HTS doença relevante aumentaria grandemente o processo de descoberta de drogas.

Neste estudo, são descritos um novo sistema de HTS, modular que visa proporcionar uma rápida e altamente flexível, mas económica, ensaio adequado para a determinação da actividade de compostos contra intracelular de M. tuberculosis. Este sistema é composto por três módulos: (i) intracelular, (ii) da citotoxicidade, e (iii) Ensaios in-caldo. O resultado final combinada fornece uma descrição detalhada das propriedades do composto, com a informação adicional quanto ao modo de potencial de acção. este screening sistema tem sido utilizado em vários projectos com várias bibliotecas de compostos, o modo de acção que têm como alvo, incluindo a análise de sinergia droga 9, a estimulação de autofagia 10, e a inibição de M. tuberculosis -secreted factor de virulcia (não publicado). Os compostos de modo desconhecido de ação também foram estudados 11. Uma versão modificada deste método foi também adoptada pelo nosso parceiro industrial como o método de rastreio primário de identificar novos compostos contra intracelular de M. tuberculosis 11.

Protocol

1. Estirpe bacteriana e Meio de Crescimento Adicione de dextrose e albumina de solução de estoque de sal (ADS) por solubilização de 25 g de albumina de soro bovino, 10,0 g de dextrose, e 4,05 g de cloreto de sódio em 460 mL de água desionizada. Filtro-esterilizar a ADS e armazenar a 4 ° C. Adicione 7H9 pela adição de 4,7 g de 7H9 em pó e 2 ml de glicerol a 900 mL de água purificada. Autoclave o 7H9 a 121 ° C durante 10 min e permita que arrefeça para a temperatura ambiente antes de cont…

Representative Results

Rastreio intracelular de alto rendimento usando M. tuberculosis expressando o gene da luciferase A Figura 2A e na Tabela 1 contém os dados brutos recolhidos pelo luminómetro, expressa em unidades luminescentes relativas (RLU), mostrando o efeito de uma concentração crescente da droga rifampicina em M. tuberculosis TB no interior das células THP-1. A Figura 2A</stron…

Discussion

O objetivo deste estudo foi o de criar um método HTS simples e de baixo custo utilizando um modelo de infecção intracelular humano para o M. tuberculosis. A tuberculose é uma doença humana caracterizado pela infecção de macrófagos alveolares por M. tuberculosis. Devido a questões de biossegurança, pesquisa envolvendo modelos biológicos, tanto da bactéria e as células hospedeiras tem sido usado no passado. No entanto, foi demonstrado que o uso de bactérias substitutos e modelos não-humano…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by BC Lung Association and Mitacs.

Materials

RPMI 1640 Sigma-Aldrich R5886
L-glutamine Sigma-Aldrich G7513
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher Scientific 12483020
Middlebrook 7H9 Becton, Dickinson and Company 271210
Tween80 Fisher Scientific T164
Albumin, Bovine pH7 Affymetrix 10857
Dextrose Fisher Scientific BP350
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358
kanamycin sulfate Fisher Scientific BP906
PMA Sigma-Aldrich P8139
MTT Sigma-Aldrich M2128
N,N-Dimethylformamide (DMF) Fisher Scientific D131
1M Hydrocholoric acid (HCl) Fisher Scientific 351279212
Acetic acid Fisher Scientific 351269
SDS Fisher Scientific BP166
Resazurin Alfa Aesar B21187
DMSO Sigma-Aldrich D5879
Glycerol Fisher Scientific BP229
THP-1 American Type Culture Collection TIB-202
M. tuberculosis H37Rv
96-well flat bottom white plate Corning 3917
95-well flat bottom clear plate Corning 3595
Transparent plate sealer Thermo Fisher Scientific AB-0580
Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific Biomate 3
Microplate spectrophotometer Biotek Epoch
luminometer Applied Biosystems Tropix TR717

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Cite This Article
Zheng, X., Av-Gay, Y. System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis. J. Vis. Exp. (122), e55273, doi:10.3791/55273 (2017).

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