Système d'efficacité et de dépistage des inhibiteurs Cytotoxicité ciblage intracellulaire<em> Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, l'agent causal de la tuberculose (TB), est une des principales causes de morbidité et de mortalité dans le monde. TB sensible aux drogues est une maladie traitable qui nécessite de multiples antibiotiques pour une période de 6 mois. En dépit d' être une maladie curable, la tuberculose mortalité a été estimée à 1,5 million en 2015 ^1. Au cours des 10 dernières années, il y a eu des préoccupations croissantes quant à la prévalence de la tuberculose M. pharmacorésistante. TB multirésistante (MDR-TB) est définie comme la tuberculose qui est résistante à au moins l'isoniazide (INH) et rifampicine (RMP), et la plupart des souches de MDR-TB sont également résistantes à sélectionner des médicaments antituberculeux de deuxième ligne, limitant ainsi les options de traitement . Les effets de la résistance aux médicaments créent un plus grand défi pour le traitement des patients co-infectés par le virus de l'immunodéficience humaine (VIH); 400.000 patients dans le monde sont morts de la tuberculose associée au VIH en 2015 ^1. Il est décevant, la Food and Drug États-Unis Administration a approuvé un seul nouveau médicament contre la tuberculose MDR-TB, bédaquiline, au cours des 40 dernières années ^2. Les progrès dans la recherche de meilleures thérapies et de la tuberculose plus courtes sont nécessaires de toute urgence afin de rester en tête dans la lutte contre la tuberculose et la tuberculose multirésistante.

Traditionnellement, les écrans de médicaments antituberculeux sont effectuées sous des conditions in vitro de la croissance dans un milieu de croissance, de sorte que les composés sont ajoutés à une culture en croissance et de leur efficacité dans l' élimination des micro – organismes sont déterminés en comptant les unités formant des colonies (CFU) sur un milieu solide. Comme UFC compte sont chronophage intensifs, la main-d'œuvre, et coûteuse, diverses méthodes indirectes ont été développées pour remédier à ce problème. Ces procédés comprennent le dosage de viabilité Alamar Bleu ^3, la détermination de la fluorescence à partir de ⁴ protéine fluorescente verte (GFP) ou la luminescence ⁵ à partir de bactéries exprimant la luciférase, et l'estimation de l' adénosine triphosphate totale (ATP) ^{6, 7.}

TB typique est caractérisée par une infection par M. tuberculosis du poumon, où les bactéries se trouvent et se répliquent à l' intérieur des phagosomes des macrophages alvéolaires ^8. L'écran phénotypiques simple bouillon peut convenir à des agents pathogènes extracellulaires; Cependant, dans la perspective historique, ont frappé des composés contre M. tuberculosis identifiés en utilisant cette méthode ne parviennent souvent pas à la hauteur des attentes au cours des étapes de validation en aval dans les modèles d'infection. Nous proposons que médicaments contre la tuberculose est mieux réalisée dans un modèle d'infection de la cellule hôte intracellulaire. Néanmoins, les modèles intracellulaires possèdent de nombreux obstacles technologiques et biologiques au développement de criblage à haut débit (HTS). Un grand obstacle est la complexité du processus d'infection, illustrée par de nombreuses étapes et l'élimination complexe de bactéries extracellulaires par lavage entre-deux. Un deuxième obstacle majeur est le long temps requirements, comme la détection de la croissance, normalement effectuée par comptage CFU sur les plaques de culture, est un processus qui prend plus de 3 semaines. Une solution pour remplacer CFU chiffres a été fournie par microscopie à fluorescence automatisée en combinaison avec des bactéries fluorescentes. Cependant, cette solution nécessite un investissement initial de l'équipement qui est hors de portée pour de nombreux laboratoires de recherche. Un simple, à faible coût, et la méthode de HTS pertinente maladie améliorerait considérablement le processus de découverte de médicaments.

Dans cette étude, nous présentons un nouveau système modulaire qui HTS vise à fournir une réponse rapide et hautement évolutive, mais économique, dosage approprié pour déterminer l'activité des composés contre intracellulaire M. tuberculosis. Ce système est composé de trois modules: (i) intracellulaire, (ii) la cytotoxicité, et (iii) des essais in-bouillon. Le résultat final combiné fournit une description complète des propriétés du composé, avec des informations supplémentaires quant au mode d'action potentiel. cette scSystème écologisation a été utilisé dans plusieurs projets avec diverses banques de composés qui ciblent le mode d'action, y compris l'analyse de la synergie des médicaments ^9, la stimulation de l' autophagie ^10, et l'inhibition de M. tuberculosis -secreted facteur de virulence (non publié). Les composés de mode d'action inconnu ont également été étudiés ^11. Une version modifiée de cette méthode a également été adoptée par notre partenaire industriel comme la principale méthode de criblage pour identifier de nouveaux composés contre la tuberculose intracellulaire M. ^11.