In vitro Differenzierung von humanen pluripotenten Zellen in Trophoblastische Stammzellen

Die Plazenta ist für das Wachstum und Überleben des Fötus während der Schwangerschaft erforderlich und erleichtert den Austausch von Gasen, Nährstoffen, Abfallprodukte und Hormone zwischen mütterlichen und fetalen Kreislauf. Das erste Organ während Säugetierembryogenese gebildet ist , der Plazenta, die bei Menschen und 3,5-4,5 Tagen bei Mäusen ^{1, 2, 3, 4} 6-7 Tagen nach der Empfängnis beginnt entwickeln. Trophoblastische Zellen sind die wichtigsten Zellen der Plazenta, und diese Zellen stellen eine der frühesten lineage Differenzierungsereignisse des Säugetierembryo. Sie ergeben sich aus den äußeren extraembryonalen Trophektoderm Zellen des preimplantation Blastozyste. Unser Wissen über die frühen Phasen der Entwicklung der Plazenta wird durch ethische und logistische Einschränkungen begrenzt auf frühe menschliche Entwicklung zu modellieren.

Während der embryonalen Implantation Trophoblastendringen in das mütterliche Epithel und unterscheiden sich in spezialisierte Vorläuferzellen ^5. Cytotrophoblasten (CTBs) sind einkernigen, undifferenzierten Vorläufern, die in Synzytiotrophoblasten (SYNs) und extravillösen invasive Trophoblasten (EVT), die Anker, die Plazenta in die Gebärmutter verschmelzen und zu differenzieren. SYNs werden, terminal differenzierte Zellen mehrkernige, die Hormone notwendig für die Aufrechterhaltung der Schwangerschaft zu synthetisieren. Die frühe Differenzierung Ereignisse , die EVTs und SYNs erzeugen , sind von wesentlicher Bedeutung für Plazentabildung, wie Beeinträchtigungen in Trophoblastzellen in einer Fehlgeburt führen, Präeklampsie und intrauterine Wachstumsrestriktion ^1. Die Typen der humanen Trophoblasten – Zelllinien , die entwickelt wurden , umfassen CTBs und Chorionkarzinome verewigt, die ⁶ Plazentahormone und Anzeige invasiven Eigenschaften herzustellen. Primäre trophoblastic Zellen aus menschlichen ersten Trimenon Plazenten isoliert werden können, aber die Zellen schnell difzieren und stoppen in vitro vermehren. Wichtig ist , transformiert und primären Zelllinien unterschiedliche Genexpressionsprofile haben, was darauf hinweist , dass tumorerzeugend und trophoblast immortalisierte Zelllinien nicht genau primäre Trophoblasten ⁷ darstellen. Darüber hinaus sind diese Linien unwahrscheinlich, dass der Plazenta Trophoblasten Stammzellen Vorläufern ähneln, weil sie von einer späteren Phase ersten bis dritten Trimester abgeleitet werden.

Es besteht ein Bedarf für ein robustes in vitro Kultursystem im Frühstadium menschlichen Trophoblasten , um die frühen Ereignisse der Plazentabildung und Funktion zu untersuchen. Menschliche embryonale Stammzellen (hES-Zellen), die Eigenschaften mit der inneren Zellmasse des preimplantation Embryo zu teilen, werden häufig zur Modellierung der frühen menschlichen Entwicklung, einschließlich der Bildung der frühen Plazenta verwendet. Beide menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) und HES – Zellen können in Trophoblasten in vitro differenziert werden unter Verwendung von Knochen Morphogenic Protein 4 (BMP – 4) , ^{8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15.} Diese Umwandlung von pluripotenten Zellen zu Trophoblastzellen BMP4 Verwendung ist für menschliche Zellen spezifisch und wird weithin verwendet , um die Entwicklung der frühen menschlichen Plazenta zu studieren , weil sie den Zugang zu frühen menschlichen Embryonen nicht erfordert ^{9, 16.} Kürzlich wurde entdeckt, daß die Zugabe der Inhibitoren A83-01 (A) und PD173074 (P), die die SMAD2 / 3 und MEK1 / 2 Signalwege blockieren, erhöht die Effizienz der Differenzierung in HPSC Trophektoderm artigen Vorläufern, hauptsächlich SYNs und EVTs, ohne die umfangreiche Erzeugung von Mesoderm, Endoderm oder Ektodermzellen ^{9, 17} </sup>. Unter Verwendung dieser Medienbedingungen differenzierte hES für 12 Tage ähnliche Gen – Expression haben Profile als Trophektoderm isolierte Zellen aus menschlichen Blastozysten-Stadium Embryonen und verschiedenen Plazentaspezifische Wachstumshormone absondern, die Unterstützung , die Gültigkeit dieses in vitro Modellsystem ^{9, 11.} Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die in vitro Differenzierung von hPSCs in menschliche Trophoblasten – Vorläufern unter Verwendung von BMP4 / A / P Kulturmedium. Diese Bedingungen erzeugen reichlich Anzahlen von Zellen für eine Vielzahl von Anwendungen, einschließlich RNA-Sequenzierung, Genzerstörung verwendet siRNAs, Pathogen-Infektionen und genetischen Modifikation unter Verwendung von Lipofektion-vermittelte Transfektion.