Summary

Producción de eliminación rápida en hongos vía<em> Agrobacterium</em> Mediated Transformation of OSCAR Deletion Constructs

Published: June 12, 2017
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Summary

Los mutantes de deleción genética generados a través de la recombinación homóloga son el patrón oro para estudios de la función génica. Se describe el método OSCAR (construcción de un solo paso de Agrobacterium-recombinación-listo-plásmidos) para la generación rápida de construcciones de deleción. Sigue la transformación de hongos mediada por Agrobacterium. Finalmente, se presenta un método de confirmación basado en PCR de deleciones de genes en transformantes fúngicos.

Abstract

La deleción precisa de los genes de interés, dejando el resto del genoma sin cambios, proporciona el producto ideal para determinar la función de ese gen particular en el organismo vivo. En este protocolo se describe el método OSCAR de construcción de plásmidos de deleción precisa y rápida. OSCAR se basa en el sistema de clonación en el que se lleva a cabo una única reacción de recombinasa que contiene los flancos 5 'y 3' amplificados por PCR purificados del gen de interés y dos plásmidos, pA-Hyg OSCAR (el vector marcador) y pOSCAR vector). La confirmación del vector de deleción correctamente ensamblado se lleva a cabo por mapeo de digestión de restricción seguido por secuenciación. Agrobacterium tumefaciens se utiliza entonces para mediar la introducción de la construcción de deleción en esporas de hongos (denominado ATMT). Por último, se describe un ensayo de PCR para determinar si la construcción de deleción se integra mediante recombinación homóloga o no homóloga, indicando deleción de gen oEctópica, respectivamente. Este enfoque se ha utilizado con éxito para la deleción de numerosos genes en Verticillium dahliae y en Fusarium verticillioides entre otras especies.

Introduction

La disección genética es una poderosa metodología para determinar la importancia funcional de individuos o combinaciones de genes. Un enfoque estándar para comprender el papel de genes específicos es la producción de mutantes de un solo gen inalterados en cualquier otro gen. El enfoque más potente y menos potencialmente confuso es la supresión completa y precisa del marco de lectura abierto de un gen de interés (GOI ORF) sin dañar ninguna otra función génica.

Debido a que los enfoques de ligación estándar para la generación de plásmidos de deleción requieren múltiples etapas, el racional para OSCAR 1 era producir un enfoque in vitro más rápido. La figura 1 representa el proceso de montaje en el enfoque de OSCAR. El método descrito aquí tiene la ventaja de combinar la construcción rápida de vectores individuales de deleción de genes en una única reacción de múltiples partes en combinación con el posterior transfo mediado por Agrobacterium tumefaciensRencia (ATMT). OSCAR es muy rápido y se compara bien con otras estrategias como el uso del ensamblaje Gibson en levadura 2 . El método OSCAR se ha utilizado con éxito con varias especies de hongos Ascomycota. Estas especies incluyen: Fusarium verticillioides (inédito), Verticillium dahliae 3 , Setosphaeria turcica 4 , Metarhizium robertsii 5 , Fusarium oxysporum f. Sp. Vasinfectum 6 , Pestalotiopsis microspora 7 , Colletotrichum higginsianum 8 y Dothistroma septosporum 9 y Sarocladium zeae (inédito) .

Este protocolo proporciona instrucciones paso a paso para el método que incluye diseño de cebador, amplificación por PCR de flanco, reacción de OSCAR BP, confirmación de estructura de construcción de deleción, transformaciónDe Agrobacterium con el constructo seguido de la transferencia basada en ATMT de la construcción de deleción en las células fúngicas y finalmente diferenciando mutantes de deleción de hongos de aquellos con construcciones de deleción ectopicamente integradas.

Protocol

1. Diseño del cebador para la amplificación por PCR de los flancos génicos Descargar a un archivo de procesamiento de texto la región genómica del gen de interés (GOI) incluyendo el marco de lectura abierto (ORF) y al menos 2 kb que flanquean el gen en cada lado de FungiDB u otro recurso de datos genómicos. Resalte el ORF destinado a la deleción y los codones de inicio y fin de la etiqueta. Identificar y resaltar ORFs adyacentes dentro de la secuencia descargada. …

Representative Results

El método OSCAR, en una única reacción, genera un plásmido que contiene los flancos del gen diana que se ha de deletar rodeando el casete marcador seleccionable. La producción de construcciones de deleción usando OSCAR es muy eficiente. Sin embargo, el sistema puede producir construcciones parciales que contienen algunos pero no todos los tres fragmentos (los dos flancos del gen y el marcador seleccionable). Generalmente, la mayoría de los transformantes de E. coli contie…

Discussion

La construcción en un solo paso de los plásmidos preparados con recombinación de Agrobacterium (OSCAR) se ha empleado con éxito con un número cada vez mayor de hongos Ascomycota. El método también debe ser fácilmente aplicable a Basidiomycota y especies de otros phylas de hongos (con promotores apropiados que conducen genes marcadores seleccionables), suponiendo que la transformación mediada por Agrobacterium y la recombinación homóloga son posibles. Se han generado vectore…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores agradecen a los siguientes estudiantes de pregrado y secundaria su trabajo para generar mutantes OSCAR en Fusarium verticillioiodes : Anjellica Miller, Athar Naseer, Xiu Lin, Katelyn Woodburry, Chelsea Patterson, Kathleen Robertson, Krystina Bradley, Ashton Rogers, Alexis McKensie y Manny Hernández Ashly Crepsac, Jeff Delong, Christian King, Gi Jeong, María Belding, Christy Burre, Daniel O'Meara, Lauren (Victoria) Cook, Jake Goodman, Sampriti De, Oge Okoye, Alyssa Beckstead, Garrett Hibbs, Nick Goldstein, Caroline Twum Chris Benson, Hannah Itell, Jane Hulse, Jasim Mohammed, James Loggins, Kelli Russell, Gre'Nisha Jones, Kristin Sheaffer, Mariam Hammady, Ava Wilson, Katrina Bazemore, Toney Harper, Karlin McGhee, Mohmed Momin, Rima Momin , Thi Ngoc Le y Angel Pham.

Materials

FungiDB Database/ http://fungidb.org/fungidb/
IDT PrimerQuest IDT Primer design online software/ http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index
Microsoft Word Sequence file manipulation
Low Na LB Spec 100 medium E. coli transformant selection, composition: 1% tryptone, 0.05% NaCl, 0.5% yeast extract, 1.5 % agar if for solid medium
Co-cultivation medium ATMT transformation induction (Reference 12)
Aspergillus minimal medium with Hygromycin Fungal transformant selection
PDA medium Acumedia 7149A Single spore slant tubes
PDA-Hyg-Kan medium Fungal ransformant isolation, PDA containing 150 μg/ml hygromycin B and 100 μg/ml Kanamycin;
Glass beads Genlantis C400100 Plate spreading
Nitrocellulose filters (47mm) Fisher 09-719-555 Co-culturing for ATMT
Various centifuge tubes multiple preps
Petri plates (various) Culturing of bacteria and Fungi
pA-Hyg OSCAR Addgene 29640 Selectable marker vector
pOSCAR Addgene 29639 Assembly vector
DH5a One Shot Competent E. coli cells Life Technologies  12297-016 BP reaction transformation
ccdB survival E. coli cells Life Technologies  A10460 Maintenance of pOSCAR
Wooden transfer sticks Colony streaking
Toothpicks Colony picking
Microcentrifuge Pelleting Bacteria etc
Preparative centrifuge Fungal spore collection
Dissecting microscope Single spore isolation
Automated Cell Counter Spore suspension calculation
Compound microscope Hemocytometer cell counting
QIAquick PCR Purification Kit  Qiagen 28104 PCR gene flank produict purification
TaKaRa LA Taq  Takara Bio USA RR002A Hi Fidelity taq polymerase for OSCAR flank generation
Hygromycin B InvivoGen ant-hg-5
Spectinomycin Sigma 22189-32-8
Cefotaxim  TCI America C2224
Moxalactam  Sigma-Aldrich 43963
GelRed  Phenix Research Products RGB-4103 Post staining agarose gels
Qiagen QIAquick PCR Purification Kit (Cat. No. 28104) 
(OneShot_ Mach1TM T1R or One Shot_ OmniMAX™ 2 T1R from Invitrogen)  Thermo Fisher Scientific C862003
Gateway BP Clonase II Enzyme mix Thermo Fisher Scientific 11789020 Used to assemble deletion construct in pOSAR
PrimerQuest tool IDT  Used in step 1.4; available on http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index

References

  1. Paz, Z., García-Pedrajas, M. D., Andrews, D. L., Klosterman, S. J., Baeza-Montañez, L., Gold, S. E. One step construction of Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids (OSCAR), an efficient and robust tool for ATMT based gene deletion construction in fungi. Fungal Genet Biol. 48 (7), 677-684 (2011).
  2. Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  3. Klosterman, S. J., et al. Comparative genomics yields insights into niche adaptation of plant vascular wilt pathogens. PLoS Pathog. 7 (7), (2011).
  4. Xue, C., Wu, D., Condon, B. J., Bi, Q., Wang, W., Turgeon, B. G. Efficient gene knockout in the maize pathogen Setosphaeria turcica using Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Phytopathology. 103 (6), 641-647 (2013).
  5. Xu, C., et al. A high-throughput gene disruption methodology for the entomopathogenic fungus Metarhizium robertsii. PloS One. 9 (9), (2014).
  6. Crutcher, F. K., Liu, J., Puckhaber, L. S., Stipanovic, R. D., Bell, A. A., Nichols, R. L. FUBT, a putative MFS transporter, promotes secretion of fusaric acid in the cotton pathogen Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum. Microbiology. 161, 875-883 (2015).
  7. Yu, X., Wang, Y., Pan, J., Wei, D., Zhu, X. High frequency of homologous gene disruption by single-stranded DNA in the taxol-producing fungus Pestalotiopsis microspora. Ann Microbiol. 65 (4), 2151-2160 (2015).
  8. Korn, M., Schmidpeter, J., Dahl, M., Müller, S., Voll, L. M., Koch, C. A Genetic Screen for Pathogenicity Genes in the Hemibiotrophic Fungus Colletotrichum higginsianum Identifies the Plasma Membrane Proton Pump Pma2 Required for Host Penetration. PloS One. 10 (5), e0125960 (2015).
  9. Chettri, P. . Regulation of dothistromin toxin biosynthesis by the pine needle pathogen Dothistroma septosporum: a thesis presented in the partial fulfilment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy (PhD) in Genetics at Massey University, Manawatu, New Zealand . , (2014).
  10. Chen Zhou, ., Yujun Yang, ., Jong, A. Y. Mini-prep in ten minutes. Biotechniques. 8 (2), 172 (1990).
  11. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. P Natl Acad SciUSA. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  12. Khang, C. H., Park, S. Y., Rho, H. S., Lee, Y. H., Kang, S., Wang, K. a. n. Filamentous fungi (Magnaporthe grisea and Fusarium oxysporum). Agrobacterium Protocols. 2, 403-420 (2007).
  13. Zhang, Y. J., Zhang, S., Liu, X. Z., Wang Wen, H. A., M, A simple method of genomic DNA extraction suitable for analysis of bulk fungal strains. Lett Appl Microbiol. 51 (1), 114-118 (2010).
  14. Pluthero, F. G. Rapid purification of high-activity Taq DNA polymerase. Nucleic Acids Res. 21 (20), 4850-4851 (1993).
  15. McCluskey, K. Boosting Research and Industry by Providing Extensive Resources for Fungal Research. Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications. , 361-384 (2016).

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Cite This Article
Gold, S. E., Paz, Z., García-Pedrajas, M. D., Glenn, A. E. Rapid Deletion Production in Fungi via Agrobacterium Mediated Transformation of OSCAR Deletion Constructs. J. Vis. Exp. (124), e55239, doi:10.3791/55239 (2017).

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