Summary

Las células dendríticas humanas de pulmón: distribución espacial y fenotípica de identificación en endobronquial biopsias mediante inmunohistoquímica y citometría de flujo

Published: January 20, 2017
doi:

Summary

Lung-resident immune cells, including dendritic cells (DCs) in humans, are critical for defense against inhaled pathogens and allergens. However, due to the scarcity of human lung tissue, studies are limited. This work presents protocols to process human mucosal endobronchial biopsies for studying lung DCs using immunohistochemistry and flow cytometry.

Abstract

The lungs are constantly exposed to the external environment, which in addition to harmless particles, also contains pathogens, allergens, and toxins. In order to maintain tolerance or to induce an immune response, the immune system must appropriately handle inhaled antigens. Lung dendritic cells (DCs) are essential in maintaining a delicate balance to initiate immunity when required without causing collateral damage to the lungs due to an exaggerated inflammatory response. While there is a detailed understanding of the phenotype and function of immune cells such as DCs in human blood, the knowledge of these cells in less accessible tissues, such as the lungs, is much more limited, since studies of human lung tissue samples, especially from healthy individuals, are scarce. This work presents a strategy to generate detailed spatial and phenotypic characterization of lung tissue resident DCs in healthy humans that undergo a bronchoscopy for the sampling of endobronchial biopsies. Several small biopsies can be collected from each individual and can be subsequently embedded for ultrafine sectioning or enzymatically digested for advanced flow cytometric analysis. The outlined protocols have been optimized to yield maximum information from small tissue samples that, under steady-state conditions, contain only a low frequency of DCs. While the present work focuses on DCs, the methods described can directly be expanded to include other (immune) cells of interest found in mucosal lung tissue. Furthermore, the protocols are also directly applicable to samples obtained from patients suffering from pulmonary diseases where bronchoscopy is part of establishing the diagnosis, such as chronic obstructive pulmonary disease (COPD), sarcoidosis, or lung cancer.

Introduction

Los pulmones están en contacto continuo con el medio externo y están muy expuestas a ambas partículas inofensivas y microbios con la capacidad de causar la enfermedad. Por lo tanto, es crítico para el sistema inmune para montar respuestas inmunes potentes contra los patógenos invasores, pero es igualmente importante para mantener la tolerancia a los antígenos inhalados que no causan enfermedad. Para proporcionar la vigilancia inmune potente, el sistema respiratorio se alinea con una red de células inmunes, incluyendo células dendríticas (DC). DC son células presentadoras de antígeno profesionales con la capacidad única de activar las células T vírgenes. En los pulmones humanos, DCs residentes encuentran un antígeno y entonces el proceso y lo transportan a los ganglios linfáticos pulmonares de drenaje para su presentación a y activación de células T 1, 2, 3.

En el sistema inmune humano, los DC se puede dividir en varios subconjuntos, con Distinct pero superpuestas funciones: CD1c + y CD141 + DC mieloides (PMD) y CD123 + plasmacytoid países en desarrollo (PDC) 4, 5. Mientras que la mayoría conocimiento detallado en países en desarrollo humano se deriva de estudios en la sangre, es ahora evidente que los pulmones humanos también albergan poblaciones raras de subconjuntos de DC con las células T capacidad estimuladora 6, 7, 8, 9. Sin embargo, la acumulación de datos muestran que las células inmunes, incluyendo países en desarrollo, difieren en su frecuencia, fenotipo y función dependiendo de su ubicación anatómica 10. Por lo tanto, es importante para estudiar las células inmunes del tejido relevante para entender su contribución a la inmunidad local y la tolerancia. En conjunto, esto pone de relieve la necesidad de estudiar las CD pulmonares residente hora de abordar las enfermedades pulmonares, a pesar de ser más fácilmente disponible y accesible sangre países en desarrollo en humanos.

Los primeros estudios que investigaron las CD pulmonares residente en el ser humano se basó principalmente en la morfología y la expresión de marcadores individuales, tales como HLA-DR y CD11c, en secciones de tejido mediante inmunohistoquímica 11, 12, 13. Por el contrario, los estudios más recientes se han basado generalmente en los análisis de citometría de flujo para estudiar diferentes subconjuntos de células inmunes. Sin embargo, ya que es difícil encontrar un solo marcador de la superficie celular que identifica de forma única un subconjunto específico de CC, la limitación potencial de los estudios aplicando citometría de flujo de cuatro colores solamente es el riesgo de incluir poblaciones de células con marcadores fenotípicos similares a los de los países en desarrollo. Por ejemplo, CD11c se expresa en todos los DC mieloides y la gran mayoría de los monocitos. Por otro lado, en los estudios de la aplicación de los paneles de citometría de flujo más avanzados, el tejido pulmonar no canceroso de resecciones quirúrgicas de los pacientes se usa típicamentexref "> 10, 14, 15, 16, aunque no está claro si estas poblaciones raras son verdaderamente representativa de los DC presente en los sujetos sanos. En general, los estudios se limitan en gran parte debido al hecho de que quirúrgicamente eliminado o tejido pulmonar humano completo es escasa.

Para superar algunas de estas limitaciones, este trabajo describe cómo realizar un análisis detallado de la distribución espacial y una identificación fenotípica de los países en desarrollo en las biopsias de mucosa de la mucosa obtenidas de voluntarios sanos que se someten a una broncoscopia. Varios biopsias pequeñas se pueden recoger de cada individuo y, posteriormente, se pueden incorporar para seccionar y el análisis mediante inmunohistoquímica o enzimáticamente digerido para el análisis avanzado de citometría de flujo. El uso de tejido pulmonar en la forma de la biopsia endobronquial obtenidos de broncoscopias confiere la ventaja de hacer posible la realización de la study en voluntarios sanos, a diferencia de la cirugía abierta de los pulmones que, por razones obvias, se limita a los pacientes que requieren cirugía torácica. Además, el tejido que se muestrea durante una broncoscopia de voluntarios sanos es fisiológicamente normal, en contraste con un área no afectada del tejido pulmonar en pacientes con una enfermedad pulmonar. Por otro lado, las biopsias son pequeñas y el número de células recuperadas, incluso cuando la agrupación de varias biopsias, limita el tipo de análisis que se pueden realizar.

Mientras que el presente trabajo se centra en los países en desarrollo, los métodos descritos se puede ampliar directamente a incluyen otras células (inmunes) de interés que residen en el tejido de la mucosa de pulmón humano. Además, los protocolos son también directamente aplicables a muestras obtenidas de pacientes que padecen enfermedades pulmonares donde broncoscopia es parte de establecer el diagnóstico, tales como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), sarcoidosis, o cáncer de pulmón.

Protocol

NOTA: Esta investigación fue aprobado por la Junta de Revisión Ética regional en Umea, Suecia. 1. La broncoscopia para el muestreo endobronquial biopsias de sujetos humanos Obtener el consentimiento informado de todos los participantes. El tratamiento de sujetos con midazolam oral (4-8 mg) y glicopirronio intravenosa (0,2 a 04 mg) 30 minutos antes de la broncoscopia. Aplicar anestesia tópica con lidocaína en la laringe y bronquios. Dejar que el haga gárgaras con ob…

Representative Results

Los estudios que caracterizan las células del tejido residente respiratorias humanas inmunes, incluyendo países en desarrollo, es limitado, debido en gran parte al hecho de que quirúrgicamente eliminado o tejido pulmonar humano completo es escasa. Aquí, un método menos invasivo para obtener tejido pulmonar a partir de biopsias endobronquiales (EBB) de voluntarios sanos y protocolos desarrollados para estudiar las células inmunes en los tejidos mediante inmunohistoquímica o citomet…

Discussion

En este documento se describe cómo generar una caracterización espacial y fenotípica detallada de las CD pulmonares de tejido residentes en los seres humanos sanos mediante inmunohistoquímica y citometría de flujo en biopsias de la mucosa endobronquiales recogidos durante la broncoscopia. En los párrafos siguientes pasos críticos en el protocolo se discuten en detalle.

Los pasos críticos con el Protocolo

Seccionamiento e inmunohistoquímica: Es fundamental p…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores desean agradecer a los voluntarios que han contribuido con material clínico de este estudio. También estamos agradecidos al personal del Departamento de Salud Pública y Medicina Clínica, División de Medicina Medicina / Respiratoria del Hospital Universitario de Umea (Norrlands universitetssjukhus) para la recogida de todo el material clínico.

Este trabajo fue apoyado por becas de AS-S desde el Consejo Sueco de Investigación, la Fundación Sueca de Corazón y Pulmón, la Fundación Sueca para la Investigación Estratégica, y el Instituto Karolinska.

Materials

Bronchoscopy
Bronchoscope BF1T160 Olympus BF1T160
Light source  Olympus Exera CV-160
Fenestrated forceps Olympus FB21C Used to take biopsies
Bite Block Conmed 1429 20x27mm
Glucose 25%  500mL intravenous
Glycopyrronium bromide 0.2mg/mL Intravenous. Prevents mucus/saliva secretion
Mixt. Midazolam 1mg/mL p.o Can be used for extra relaxation
Lidocaine, 40mg/mL Mouth and throat administration / Gargled
Lidocaine 100mg/ml spray Administered to back of throat
Lidocaine 20mg/ml spray Administered via bronchoscope to airways
Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
GMA processing and embedding
Glass vials 5mL
Acetone Sigma-Aldrich 32201-1L
Molecular sieves, 4A Alfa Aesar 88120 3-4mm diameter pellets
Phenylmethylsulfonyl fluoride Sigma-Aldrich P-7626 0.035g/100ml acetone
Iodoacetamide Sigma-Aldrich I-6125 0.37g/100ml acetone
Polythene-flat  TAAB embedding capsules TAAB laboratories C094 x500 8mm diameter, polythene, flat-bottom capsules
Capsule holder TAAB laboratories C054 Holds 25 8mm capsules
JB-4 GMA embedding kit Polysciences 00226 Contains JB-4 Solution A (0026A-800), JB-4 solution B (0026B-3.8), benzoyl peroxide (02618-12)
Methyl benzoate Sigma-Aldrich 27614-1L
Silica gel with humidity indicator Scharlau GE0043 2.5-6mm 
Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
GMA sectioning
Glass microscope slides ThermoFisher Scientific 10143562CEF Cut edges, frosted end
Poly-L-Lysine solution Sigma-Aldrich P8920-500mL 1:10 for working solution
Sheet glass strips for ultramicrotomy Alkar
Tween 20 Sigma-Aldrich P2287 Wash solution (0.1% Tween20)
LKB 7800B Knifemaker LKB
Capsule splitter TAAB laboratories C065
Carbon steel single edge blades TAAB laboratories B054
Vice
Ammonia, 25% VWR 1133.1000 2mL in 1L, 1:500 (0.05%)
Microtome Leica Leica RM 2165
Light source Leica Leica CLS 150 XE
Microscope with swing arm stand Leica Leica MZ6
Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
GMA Immunohistochemistry
Diamond tipped pen Histolab 5218
Hydrogen peroxide 30% solution AnalaR Normapur 23619.264
Sodium azide Sigma-Aldrich S8032
Tris Roche 10708976001
Sodium chloride VWR chemicals 27810.295
Bovine serum albumin Millipore 82-045-2 Probumin BSA diagnostic grade
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) Sigma-Aldrich D5546
Anti-human CD45 antibody BioLegend 304002 Mouse monoclonal, clone HI30, isotype IgG1k. Working concentration of 500 ng/ml
Anti-human CD1a antibody AbD Serotech MCA80GA Mouse monoclonal, clone NA1/34-HLK, isotype IgG2a. Working concentration of 10 µg/ml
Mouse monoclonal IgG1 isotype control Abcam ab27479
Mouse monoclonal IgG2a isotype control Dako X094301-2
Vectastain ABC Elite standard kit Vector Labs PK-6100
AEC (3-amino-9-ethylcarbazole) peroxidase substrate kite Vector Labs SK-4200
Mayers haematoxylin HistoLab 01820
Permanent Aqueous Mounting Medium AbD Serotech BUF058C
Drying oven
DPX permanent mounting solution  VWR 360292F
Light microscope Leica Leica DMLB
Microscope camera Leica Leica DFC 320
Analysis software Leica Leica Qwin V3
Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Enzymatic digestion
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Sigma-Aldrich 55021C
Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich DTT-RO
Collagenase II Sigma-Aldrich C6885
DNase Sigma-Aldrich 10104159001 ROCHE
RPMI 1640 Sigma-Aldrich R8758
Forceps
Platform rocker Grant instruments PMR-30
50 mL conical tubes Falcon 14-432-22
40 µm cell strainer Falcon 352340
Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Flow cytometry
Phosphate Buffered Saline (PBS)
LIVE/DEAD Aqua fixable dead cell stain kit Life Technologies L34957
CD45 BD 555485
CD3 BD 557757
CD20 BD 335829
CD56 Biolegend 318332
CD66abce Miltenyi 130-101-132
HLA-DR BD 555813
CD14 BD 557831
CD16 Biolegend 302026
CD11c BD 560369
CD1c Miltenyi 130-098-009
CD141 Miltenyi 130-090-514
CD103 Biolegend 350212
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich F8775
LSR II Flow cytometer BD Flow cytometer
FlowJo FlowJo Software for analysis

References

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Baharom, F., Rankin, G., Scholz, S., Pourazar, J., Ahlm, C., Blomberg, A., Smed-Sörensen, A. Human Lung Dendritic Cells: Spatial Distribution and Phenotypic Identification in Endobronchial Biopsies Using Immunohistochemistry and Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (119), e55222, doi:10.3791/55222 (2017).

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