Visualizzazione di interazione proteina-proteina in nucleare e citoplasmatica frazioni da Co-immunoprecipitazione e<em> In Situ</em> Proximity Assay legatura
Summary
Protein-protein interactions can occur in both the nucleus and the cytoplasm of a cell. To investigate these interactions, traditional co-immunoprecipitation and modern proximity ligation assay are applied. In this study, we compare these two methods to visualize the distribution of NF90-RBM3 interactions in the nucleus and the cytoplasm.
Abstract
Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation is a popular technique to detect protein-protein interactions. Subsequent Western blot analysis is the most common method to visualize co-immunoprecipitated proteins. Recently, the proximity ligation assay has become a powerful tool to visualize protein-protein interactions in situ and provides the possibility to quantify protein-protein interactions by this method. Similar to conventional immunocytochemistry, the proximity ligation assay technique is also based on the accessibility of primary antibodies to the antigens, but in contrast, proximity ligation assay detects protein-protein interactions with a unique technique involving rolling-circle PCR, while conventional immunocytochemistry only shows co-localization of proteins.
Nuclear factor 90 (NF90) and RNA-binding motif protein 3 (RBM3) have been previously demonstrated as interacting partners. They are predominantly localized in the nucleus, but also migrate into the cytoplasm and regulate signaling pathways in the cytoplasmic compartment. Here, we compared NF90-RBM3 interaction in both the nucleus and the cytoplasm by co-immunoprecipitation and proximity ligation assay. In addition, we discussed the advantages and limitations of these two techniques in visualizing protein-protein interactions in respect to spatial distribution and the properties of protein-protein interactions.
Introduction
Fattore nucleare 90 (NF90) è una proteina multi-isoforma con numerose funzioni, tra cui la risposta all'infezione virale, regolazione di interleuchina-2 post-trascrizione e regolazione dei miRNA biogenesi 1-3. RBM3 è una proteina RNA-binding, coinvolto nella traduzione e miRNA biogenesi e può essere indotta da vari fattori di stress, tra cui l'ipotermia e ipossia 4-6. Recentemente, abbiamo trovato NF90 e RBM3 in un complesso proteico 7. L'interazione di NF90 e RBM3 è essenziale per modulare l'attività della proteina chinasi RNA-like chinasi reticolo endoplasmatico (PERK) in risposta proteina spiegato 7. Sia NF90 e RBM3 si trovano prevalentemente nel nucleo, ma una piccola percentuale di NF90 e navetta RBM3 nel citoplasma e si legano lì gli uni agli altri per funzioni specifiche, ad esempio, per regolare l'attività vantaggio. Pertanto, è importante visualizzare la distribuzione delle interazioni NF90-RBM3 nel compartimento subcellulare, che può indicareloro diversi ruoli nel rispettivo comparto.
Decenni fa, lievito due ibridi (Y2H) è stato sviluppato per rilevare l'interazione tra due proteine 8. Tuttavia, a causa della costruzione artificiale di proteine fuse, risultati falsi positivi hanno limitato l'applicazione di questo metodo. Per lungo tempo, co-immunoprecipitazione era la tecnica principale per analizzare le interazioni proteina-proteina, specialmente in condizioni endogene 9. Per analizzare il complesso proteico co-immunoprecipitato, Western blot è la tecnica più conveniente, mentre la spettrometria di massa è usato quando eccellente sensibilità e la precisione sono desiderati. Negli ultimi anni, saggio di prossimità legatura è stato sviluppato come un nuovo metodo per rilevare interazioni proteina-proteina in entrambe le cellule e tessuti in situ 10,11.
Qui, abbiamo confrontato il più popolare metodo di co-immunoprecipitazione e relativamente nuovo metodo di analisi di prossimità legatura a catturare NF9Interazione 0-RBM3 in frazioni subcellulari. Abbiamo anche discusso i vantaggi ei limiti di entrambe le tecniche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ci sono diversi vantaggi e carenze per entrambi i metodi. Come relativamente nuova tecnica, un evidente vantaggio di dosaggio vicinanza legatura è la possibilità di chiarire le interazioni proteina-proteina a livello di singola cellula, invece di un lotto di cellule eterogenee. Immagini ad alta intensità e la risoluzione (ad esempio con microscopio confocale) prevedono la possibilità per la quantificazione contando macchie fluorescenti singoli. Al contrario, la combinazione convenzionale di tecnica di co-im…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by the Swiss National Science Foundation (SNSF, 31003A_163305).
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma | D6429 | High glucose 4500 mg/L |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
| Penicillin-Streptomycin (PenStrep) | BioConcept | 4-01F00-H | |
| NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents | Thermo Fisher Scientific | 78833 | |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Carl Roth | 6908.3 | |
| Dynabeads Protein G | Novex, Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| DRBP76 (NF90/NF110) antibody | BD Transduction Laboratories | 612154 | use 1:1000 for WB and 1:100 for ICC/PLA |
| RBM3 antibody | ProteinTech | 14363-1-AP | use 1:1000 for WB and 1:100 for ICC/PLA |
| Lamin A/C antibody | Cell Signaling Technology | #2032 | use 1:1000 for WB |
| anti-GAPDH antibody | Abcam | ab8245 | use 1:1000 for WB |
| normal rabbit IgG | Santa Cruz | sc-2027 | |
| anti-rabbit IgG, HRP-lined secodary antiboy | Cell Signaling Technology | #7074 | use 1:5000 for WB |
| anti-mouse HRP secondary antibody | Carl Roth | 4759.1 | use 1:5000 for WB |
| Clarity Western ECL Blotting Substrate | Bio-Rad | #1705060 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP0321BOX | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP0007 | |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | CarlRoth | 6908.1 | |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP0002 | |
| NuPAGE Transfer Buffer (20x) | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP00061 | |
| Amersham Hypond P 0.2 PVDF membrane | GE Healthcare Life Sciences | 10600021 | |
| Super RX X-ray film | Fujifilm | 4741029230 | |
| Poly-D-Lysine 8 Well Culture Slide | Corning BioCoat | 354632 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Normal goat serum (NGS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | |
| Goat anti-mouse IgG (H+L Antibody), Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L Antibody), Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11011 | |
| 4′, 6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| Duolink PLA probe Anti-mouse PLUS | Sigma | DUO92001 | |
| Duolink PLA probe Anti-rabbit MINUS | Sigma | DUO92005 | |
| Duolink Detection Reagents Red | Sigma | DUO92008 | |
| Duolink Wash Buffers Fluorescence | Sigma | DUO82049 | |
| Duolink Mounting Medium with DAPI | Sigma | DUO82040 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma | 81381 | |
| Microscope | Olympus | AX-70 | |
| CCD camera | SPOT | Insight 2MP Firewire | |
| X-ray film | Fujifilm | Super RX | |
| Film processing machine | Fujifilm | FPM-100A |
References
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