Summary

İlkel ve kesin hematopoetik ataları insan Pluripotent kök hücrelerden farklılaşma yönetmen

Published: November 01, 2017
doi:

Summary

Burada, insan pluripotent kök hücre (hPSC) kültür hPSCs CD34 ayırt etmek için kullanılan iletişim kuralları, mevcut+ hematopoetik ataları. Bu yöntem kurallı WNT ya kesin veya ilkel hematopoetik program sadece hücrelere belirtmek sinyal manipülasyon sahne özgü kullanır.

Abstract

Rejeneratif tıp için önemli amaçlarından biri üretimi ve hematopoetik kök hücre (HSCs) insan pluripotent kök hücrelerden (hPSCs) elde edilen bakımı sağlamaktır. Yakın zamana kadar hPSCs HSCs ayırt etmek için çabaları ağırlıklı olarak HSC potansiyel eksikliği ve bunun yerine sarısı sac hematopoiesis benzer hematopoetik ataları üretilip. Elde edilen bu hematopoetik ataları yarar vitro hastalığı modelleme çeşitli yetişkin hematopoetik bozukluklar, özellikle de lenfoid soy için sınırlı olabilir. Ancak, son zamanlarda erythro-myelo-lenfoid multilineage kesin hematopoetik ataları burada anahat bir sahne özel yönlendirilmiş ayırt etme protokolünü kullanarak hPSCs oluşturmak için yöntemleri anlatmıştık. Enzimatik ayrılma hPSCs membran matris kaplı plasticware Tarih, embryoid organları (EBs) oluşur. EBs farklı mesoderm için kesin hematopoetik programa GSK3β inhibitörü, CHIR99021 daha sonra belirtilen rekombinant BMP4 tarafından. Alternatif olarak, ilkel hematopoiesis PORCN inhibitörü, IWP2 belirtilir. Hematopoiesis daha fazla rekombinant VEGF eklenmesi ve destekleyici hematopoetik sitokinler sürülür. Bu yöntem kullanılarak oluşturulan elde edilen hematopoetik ataları hastalık ve gelişimsel modelleme, içinde vitroiçin kullanılmak üzere potansiyeline sahiptir.

Introduction

İnsan pluripotent kök hücreler (hPSCs) insan embriyonik kök hücreleri (hESCs) ve İnsan İndüklenmiş pluripotent kök hücreler (hiPSCs) kapsayan olarak tanımlanır ve uygun büyüme koşullarda kendini yenileme geçiren sadece benzersiz yeteneği var, Ama aynı zamanda, tüm hücre türleri ayırt etmek için kapasite elde edilen üç germ katmanlardan: endoderm, mesoderm ve ektoderm1. Bu benzersiz yetenekleri nedeniyle hPSCs rejeneratif tıp, hastalık modelleme ve hücre tabanlı terapiler2büyük sözü tutun. Birden çok hücre tipleri başarıyla hPSCs farklılaşmış iken, bir önemli sorun sadece yetişkin gibi hPSC kaynaklı hematopoetik kök hücre (HSCs) ve kesin hematopoetik ataları vitro belirtimidir.

Bir büyük olasılıkla insan HSCs geliştirilmesi için hPSCs gelen insan embriyo3içinde birden çok hematopoetik program varlığı engeldir. Ortaya çıkıyor, “ilkel hematopoiesis,” olarak adlandırdığı ilk programı içinde extraembryonic sarısı sac doku kaynaklı ve geçici üretiminin erythroblast ataları (EryP-CFC), makrofajlar ve megakaryocytes tarafından en iyi karakterizedir. Özellikle, bu bilgisayar programı does değil vermek artış HSCs için ne o does vermek artış T ve B lenfoid ataları için. Ancak, sarısı sac geçici erythro myeloid yaratıcı (EMP4,5,6,7,8) gibi sınırlı kesin hematopoetik ataları ortaya çıkmasına ve erythroid-eksik lenfoid astarlanmalıdır multipotent progenitör (LMPP9). Ancak, tam olarak multipotent veya yetişkin alıcılar HSC benzeri engraftment yeteneğine ne EMP’leri ne de LMPPs. Buna ek olarak, daha sonra gelişmede, embriyonun uygun, HSC dahil olmak üzere tüm yetişkin hematopoetik soy için sebebiyet veren aort-erbezi-mesonephros bölgesinde klasik tanımlamak “kesin” hematopoetik bilgisayar programı belirtilir. Endotel-için-hematopoetik geçişe hemogenic endotel (o)3,10,11 üzerinden bir çentik bağımlı moda bu içi embriyonik kesin hematopoetik hücreler tayini oluşur ,12,13,14. Sulandırma kapasitesi dışında EMP ve (gözden başvuruları3‘ te,13 LMPP bu kesin hematopoetik ataları ayırmak için multilineage potansiyel ve çentik-bağımlılık bu hücre kullanılabilir ).

HPSCs ilkel ve kesin hematopoetik belirtiminden yöneten mechanism(s) anlama olası hPSC hatları çeşitli genelinde kesin hematopoetik ataları tekrarlanabilir üretimi için önemlidir. Yakın zamana kadar multipotent ilkel ve kesin hematopoetik ataları ayrı hPSC farklılaşma protokolleri15,16,17,18yoktu, 19,20,21,22,23,24,25. Pek çok yaklaşım fetal sığır serum (FBS) ve/veya stromal ortak kültür ilk kullanarak ilkel kesin hematopoetik potansiyel15,ve16karışımları ile hPSC farklılaşma potansiyeli hematopoetik özetlenen, 17,19,22,23,25. Ayrıca, birçok serum-Alerjik hematopoetik protokolleri mesoderm hematopoetik potansiyel18,20,21, liman hPSCs üzerinden tayini için sinyal gereksinimleri tarif var 24. ancak, bu yöntemleri hala her iki program heterojen karışımları için doğuran gibi kullanımları klinik uygulamaları ve anlayış gelişimsel mekanizmaları sınırlı olabilir.

Biz son zamanlarda AKTİVİN/NODAL ve hPSC elde edilen mesoderm18,26 hematopoetik belirtiminde ilkel ve kesin WNT sinyal için sahne özel sinyal gereksinimleri ana hatlarıyla bu çalışmalar, yerleşik . İkincisi özellikle benzersiz sahne özgü WNT sinyal işleme kullanımı sadece ilkel ya da sadece kesin hematopoetik ataları26belirtimi için sağlar. Sırasında mesoderm belirtimi, kurallı WNT sinyal PORCN inhibitörü IWP2 ile inhibisyon CD43 belirtiminde sonuç+ EryP-CFC ve hiçbir tespit lenfoid potansiyeli ile Miyeloid ataları. Keskin aksine, kurallı WNT GSK3β inhibitörü ile CHIR99021, farklılaşma aynı aşaması sırasında sinyal stimülasyon tespit CD43 tam yokluğunda sonuçlandı.+ aynı anda lider ise EryP-CFC, için CD34 tayini+CD43 o. Bu nüfus sahip Miyeloid, HBG-erythroid ve T-lenfoid potansiyeli ifade etmek. Daha sonraki analizler bu CD7327,28 ve CD18428ve hematopoetik potansiyel ifadesi eksik olarak ÇENTİK bağımlı28olduğunu tespit etti. Ayrıca, tek hücreli klonal analizleri bu kesin hematopoetik soy multipotent tek hücreleri28elde edilebilir gösterdi. Birlikte ele alındığında, bu çalışmalar sahne özgü WNT sinyal işleme saf ilkel hematopoetik ataları veya multipotent ÇENTİK bağımlı kesin hematopoetik ataları belirtebilirsiniz gösteriyor.

Burada, biz sadece ilkel veya kesin hematopoetik ataları, kurallı WNT Mezodermal desenlendirme ve onların aşağı akım hematopoetik soyu sırasında deneyleri sinyal manipülasyonu yoluyla verir bizim farklılaşma strateji anahat. Bu ilkel veya kesin hematopoetik ataları hPSCs rejeneratif tıp uygulamaları için gelen üretiminde ilgilenen araştırmacılar için çok değerli bir protokoldür.

Protocol

1. reaktifler elde edilir hücre çizgileri; hESCs veya hiPSCs 1, fare embriyonik fibroblastlar (MEFs) 29, OP9-DL4 stroma 30 , 31. reaktif hazırlık PBS içinde jelatin % 0,1 w/v çözeltisi hazırlamak. Tarafından ısıyla sterilize ve aliquoting sonra 4 ° C’de depolayın. Hazırla jelatin kaplı plasticware. 6-iyi yemekleri 1,5 mL %0,1 jelatin çözelti…

Representative Results

İlkel ve kesin hematopoetik ataları hPSCs üzerinden indüksiyon resmeden bir şematik Resim 1′ de gösterilmiştir. Kurallı WNT gün 2-3 farklılaşma, hematopoetik progenitör belirtimine göre takip sırasında ortaya çıkan sinyal tarafından biçimlenme mesoderm. Temsilcisi akış sitometrik çözümlemesi ve methylcellulose deneyleri hematopoetik farklılaşma hPSC kaynaklı kültürlerin …

Discussion

Bu iletişim kuralı için ilkel veya kesin hematopoetik ataları farklılaşma hızlı, serum-Alerjik, stroma ücretsiz yöntemi açıklar. Mezodermal ilkel veya kesin hematopoetik ataları tayini güvenilir benzersiz olarak kanonik WNT sinyal, küçük molekül inhibitörleri patlatır bizim iletişim kuralı kullanılarak elde edilebilir. WNT inhibisyon PORCN inhibitörü IWP234 tarafından ilkel hematopoetik mesoderm26belirtir, ancak sahne alanı özgü WNT etkinleştir…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser Bakanlığı iç hastalıkları, Hematoloji bölümü, Washington Üniversitesi Tıp Fakültesi tarafından desteklenmiştir. CD T32HL007088 Ulusal kalp, akciğer ve kan Enstitüsü tarafından desteklenmiştir. CMS bir Amerikan Derneği, Hematoloji bilim adamı Ödülü tarafından desteklenmiştir.

Materials

Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMD) Corning 10-016
Fetal Bovine Serum (FBS), ES cell rated Gemini Bioproducts 100-500
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone SH30396.03
L-glutamine, 200 mM solution Life Technologies 25030-081
Penicillin-streptomycin Life Technologies 15070-063
0.25% Trypsin-EDTA Life Technologies 25200056
0.05% Trypsin-EDTA Life Technologies 25300054
Gelatin, porcine skin, Type A Sigma-Aldrich G1890
Alpha-MEM Life Technologies 12000-022
DMEM-F12 Corning 10-092-CV
Knock-out serum replacement Life Technologies 10828028 "KOSR"
Non-essential amino acids (NEAA) Life Technologies 11140050
b-mercaptoethanol, 55 mM solution Life Technologies 21985023
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich H1758
Fraction V, Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1605
Ham's F12 Corning 10-080
N2 supplement Life Technologies 17502048
B27 supplement, no vitamin A Life Technologies 12587010
Stempro-34 (SP34) Life Technologies 10639011 "SP34"
Growth factor reduced Matrigel Corning 354230 "MAT"
L-absorbic acid Sigma-Aldrich A4403
Human serum transferrin Sigma-Aldrich 10652202001
Monothioglycerol (MTG) Sigma-Aldrich M6145
Collagenase B Roche 11088831001
Collagenase II Life Technologies 17101015
DNaseI Calbiochem 260913
Phosphate Buffered Saline (PBS) Life Technologies 14190144
bFGF R&D Systems 233-FB
BMP4 R&D Systems 314-BP
Activin A R&D Systems 338-AC
VEGF R&D Systems 293-VE
SCF R&D Systems 255-SC
IGF-1 R&D Systems 291-G1
IL-3 R&D Systems 203-IL
IL-6 R&D Systems 206-IL
IL-7 R&D Systems 207-IL
IL-11 R&D Systems 218-1L
TPO R&D Systems 288-TP
EPO Peprotech 100-64
Flt-3 ligand (FLT3-L) R&D Systems 308-FK
CHIR99021 Tocris 4423
IWP2 Tocris 3533
Angiotensin II Sigma-Aldrich A9525
Losartan Potassium Tocris 3798
CD4 PerCP Cy5.5 Clone RPA-T4 BD Biosciences 560650 Dilution 1:100; T cell assay
CD8 PE Clone RPA-T8 BD Biosciences 561950 Dilution 1:10; T cell assay
CD34 APC Clone 8G12 BD Biosciences 340441 Dilution 1:100; EHT assay
CD34 PE-Cy7 Clone 8G12 BD Biosciences 348801 Dilution 1:100; Hemogenic endothelium
CD43 FITC Clone 1G10 BD Biosciences 555475 Dilution 1:10; Hemogenic endothelium
CD45 APC-Cy7 Clone 2D1 BD Biosciences 557833 Dilution 1:50; T cell assay
CD45 eFluor450 Clone 2D1 BD Biosciences 642284 Dilution 1:50; EHT assay
CD56 APC Clone B159 BD Biosciences 555518 Dilution 1:20; T cell assay
CD73 PE Clone AD2 BD Biosciences 550257 Dilution 1:50; Hemogenic endothelium
CD184 APC Clone 12G5 BD Biosciences 555976 Dilution 1:50; Hemogenic endothelium
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) BD Biosciences 564907 Dilution 1:10,000; T cell assay
OP9 DL4 cells Holmes, R. and J.C. Zuniga-Pflucker. Cold Spring Harb Protoc, 2009. 2009(2): p. pdb prot5156
MethoCult H4034 Stemcell Technologies 4034 "MeC"
Milli-Q water purification system EMD Millipore
5% CO2 incubator Set at 37 C
Multigas incubator Set at 37 C, 5% CO2, 5% O2
6 well tissue culture plate Corning 353046
24 well tissue culture plate Corning 353226
6 well low-adherence tissue culture plate Corning 3471
24 well low-adherence tissue culture plate Corning 3473
35 mm tissue culture dishes Corning 353001
Blunt-end needle, 16 gauge Corning 305198
3 cc syringes Corning 309657
5 mL polypropylene test tube Corning 352063
5 mL polystyrene test tube Corning 352058
15 mL polypropylene conical Corning 430791
50 mL polypropylene conical Corning 430921
2 mL serological pipette Corning 357507
5 mL serological pipette Corning 4487
10 mL serological pipette Corning 4488
25 mL serological pipette Corning 4489
Cell scrapers Corning 353085
2.0 mL cryovials Corning 430488
5 mL test tube with 40 µM cell strainer Corning 352235
40 µM cell strainer Corning 352340
Cell culture centrifuge
Biosafety hood
FACS AriaII or equivalent
LSRii or equivalent
FlowJo software TreeStar
Water bath Set at 37 C
0.22 µM filtration system Corning
Autoclave
4 C refrigerator
-20 C Freezer
-80 C Freezer

References

  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  2. Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 132 (4), 661-680 (2008).
  3. Ditadi, A., Sturgeon, C. M., Keller, G. A view of human haematopoietic development from the Petri dish. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (1), 56-67 (2017).
  4. Chen, M. J., et al. Erythroid/myeloid progenitors and hematopoietic stem cells originate from distinct populations of endothelial cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 541-552 (2011).
  5. McGrath, K. E., et al. Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo. Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).
  6. McGrath, K. E., et al. A transient definitive erythroid lineage with unique regulation of the beta-globin locus in the mammalian embryo. Blood. 117 (17), 4600-4608 (2011).
  7. Palis, J., et al. Spatial and temporal emergence of high proliferative potential hematopoietic precursors during murine embryogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (8), 4528-4533 (2001).
  8. Palis, J., Robertson, S., Kennedy, M., Wall, C., Keller, G. Development of erythroid and myeloid progenitors in the yolk sac and embryo proper of the mouse. Development. 126 (22), 5073-5084 (1999).
  9. Boiers, C., et al. Lymphomyeloid contribution of an immune-restricted progenitor emerging prior to definitive hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 13 (5), 535-548 (2013).
  10. Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).
  11. Hadland, B. K., et al. A requirement for Notch1 distinguishes 2 phases of definitive hematopoiesis during development. Blood. 104 (10), 3097-3105 (2004).
  12. Kumano, K., et al. Notch1 but not Notch2 is essential for generating hematopoietic stem cells from endothelial cells. Immunity. 18 (5), 699-711 (2003).
  13. Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions. Development. 138 (6), 1017-1031 (2011).
  14. Robert-Moreno, A., Espinosa, L., de la Pompa, J. L., Bigas, A. RBPjkappa-dependent Notch function regulates Gata2 and is essential for the formation of intra-embryonic hematopoietic cells. Development. 132 (5), 1117-1126 (2005).
  15. Chadwick, K., et al. Cytokines and BMP-4 promote hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells. Blood. 102 (3), 906-915 (2003).
  16. Davis, R. P., et al. Targeting a GFP reporter gene to the MIXL1 locus of human embryonic stem cells identifies human primitive streak-like cells and enables isolation of primitive hematopoietic precursors. Blood. 111 (4), 1876-1884 (2008).
  17. Kaufman, D. S., Hanson, E. T., Lewis, R. L., Auerbach, R., Thomson, J. A. Hematopoietic colony-forming cells derived from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (19), 10716-10721 (2001).
  18. Kennedy, M., et al. T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2 (6), 1722-1735 (2012).
  19. Ledran, M. H., et al. Efficient hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells on stromal cells derived from hematopoietic niches. Cell Stem Cell. 3 (1), 85-98 (2008).
  20. Ng, E. S., et al. The primitive streak gene Mixl1 is required for efficient haematopoiesis and BMP4-induced ventral mesoderm patterning in differentiating ES cells. Development. 132 (5), 873-884 (2005).
  21. Pick, M., Azzola, L., Mossman, A., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. Differentiation of human embryonic stem cells in serum-free medium reveals distinct roles for bone morphogenetic protein 4, vascular endothelial growth factor, stem cell factor, and fibroblast growth factor 2 in hematopoiesis. Stem Cells. 25 (9), 2206-2214 (2007).
  22. Vodyanik, M. A., Bork, J. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. Human embryonic stem cell-derived CD34+ cells: efficient production in the coculture with OP9 stromal cells and analysis of lymphohematopoietic potential. Blood. 105 (2), 617-626 (2005).
  23. Vodyanik, M. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. Leukosialin (CD43) defines hematopoietic progenitors in human embryonic stem cell differentiation cultures. Blood. 108 (6), 2095-2105 (2006).
  24. Yu, C., et al. Retinoic acid enhances the generation of hematopoietic progenitors from human embryonic stem cell-derived hemato-vascular precursors. Blood. 116 (23), 4786-4794 (2010).
  25. Zambidis, E. T., Peault, B., Park, T. S., Bunz, F., Civin, C. I. Hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells progresses through sequential hematoendothelial, primitive, and definitive stages resembling human yolk sac development. Blood. 106 (3), 860-870 (2005).
  26. Sturgeon, C. M., Ditadi, A., Awong, G., Kennedy, M., Keller, G. Wnt Signaling Controls the Specification of Definitive and Primitive Hematopoiesis From Human Pluripotent Stem Cells. Nat Biotechnol. 32 (6), 554-561 (2014).
  27. Choi, K. D., et al. Identification of the hemogenic endothelial progenitor and its direct precursor in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2 (3), 553-567 (2012).
  28. Ditadi, A., et al. Human Definitive Haemogenic Endothelium and Arterial Vascular Endothelium Represent Distinct Lineages. Nat Cell Biol. 17 (5), 580-591 (2015).
  29. Conner, D. A. Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 23, (2001).
  30. La Motte-Mohs, R. N., Herer, E., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T-cell development from human cord blood hematopoietic stem cells by Delta-like 1 in vitro. Blood. 105 (4), 1431-1439 (2005).
  31. Schmitt, T. M., et al. Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro. Nat Immunol. 5 (4), 410-417 (2004).
  32. Holmes, R., Zuniga-Pflucker, J. C. The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (2), (2009).
  33. Polychronopoulos, P., et al. Structural basis for the synthesis of indirubins as potent and selective inhibitors of glycogen synthase kinase-3 and cyclin-dependent kinases. J Med Chem. 47 (4), 935-946 (2004).
  34. Chen, B., et al. Small molecule-mediated disruption of Wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer. Nat Chem Biol. 5 (2), 100-107 (2009).
  35. Sugimura, R., et al. Haematopoietic stem and progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature. , (2017).
  36. Ohgushi, M., et al. Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).
  37. Peschle, C., et al. Embryonic—-Fetal Hb switch in humans: studies on erythroid bursts generated by embryonic progenitors from yolk sac and liver. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (8), 2416-2420 (1984).

Play Video

Cite This Article
Dege, C., Sturgeon, C. M. Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (129), e55196, doi:10.3791/55196 (2017).

View Video