Summary

Подготовка горизонтальных слоев взрослых мышей Retina для электрофизиологических исследований

Published: January 27, 2017
doi:

Summary

Мы разработали горизонтальный срез препарата сетчатки у млекопитающих взрослого с плоскостью секционирования параллельно поверхности сетчатки. Дендритные поля нерадиально ориентированных нейронов сетчатки не были усечены, что позволяет изучение обработки сигналов с накладными-смыкания и визуализации методов.

Abstract

Вертикальные препараты срезов хорошо разработаны для изучения схемы и передачи сигнала в сетчатке млекопитающих взрослого. Плоскость секционирования в этих препаратах, перпендикулярно к поверхности сетчатки, что делает его идеальным для изучения радиально ориентированных нейронов, таких как фоторецепторов и биполярных клеток. Тем не менее, крупные дендритные беседок горизонтальных клеток, клеток амакринных широкоугольных и ганглиозных клеток в основном усеченный, в результате чего заметно пониженную синаптической активности в этих клетках. В то время как ганглиозные клетки и перемещенные амакринные клетки могут быть изучены в целом монтажа подготовки сетчатки, горизонтальные клетки и амакринные клетки, расположенные во внутреннем ядерном слое лишь слабо доступны для электродов в цельной ткани сетчатки глаза.

Для достижения максимальной доступности и синаптическую целостности, мы разработали горизонтальную подготовку срезов сетчатки мыши, а также изучал передачу сигнала в синапсах между фоторецепторов и горизонтальнымклетки. Горизонтальное секционирование позволяет (1) простой и однозначный визуальной идентификации горизонтальных клеточных тел для электрода адресности и (2) сохранение расширенной горизонтальной ячейки дендритных полей, в качестве предпосылки для неповрежденного и функционального конуса синаптической вход горизонтальных дендритов клеток.

Горизонтальные клетки из горизонтальных слоев выставлены тонизирующее синаптической активности в темноте, и они ответили на короткие световые вспышки с уменьшением внутреннего тока и пониженной синаптической активности. Иммуноцитохимическая данные свидетельствуют о том, что почти все конусы в пределах дендритной области горизонтальной ячейки установить синапсы с его периферийными дендритов. Горизонтальный срез подготовка поэтому хорошо подходит для изучения физиологических свойств горизонтально протяженных нейронов сетчатки, а также сенсорную передачу сигнала и интеграции между выбранными синапсов.

Introduction

Визуальная информация кодируется как динамический пространственно-временной паттерн активации фоторецепторов, и лента синапс между фоторецепторов и нейронов второго порядка определяет передачу вниз по течению визуальной информации. Вертикальная подготовка срез сетчатки млекопитающего является весьма ценным инструментом для изучения обработки сигналов в вертикальных путей, то есть между фоторецепторов и биполярных клеток, а также между биполярными клетками и некоторыми типами амакринных ячейки 1, 2, 3, 4.

Тем не менее, вертикальные секционирования всегда вызывает сильную усечение дендритных полей многих нейронов сетчатки, что приводит к значительной потере синаптических контактов. Особенно во внешней сетчатки, горизонтальные клетки страдают из – за их в боковом направлении распространяются расширенных дендритных полей и аксона систем 5. В вертикальномПодготовка ломтик, синаптической вход сотен колбочек терминалов к дендритов горизонтальной ячейки, таким образом, сводится к нескольким разреженных контактов. Это может быть достаточно, чтобы изучить свойства отдельных синапсов, но это ни в коей мере не представляют возможности обработки сигналов, лежащих в основе синхронизированного активацию фоторецепторов ленты синапсов.

Поэтому мы разработали горизонтальный срез препарат, который оставляет почти все фоторецепторов конуса синаптическую вход для горизонтальных дендритов клеток нетронутыми и функциональным. Самолет секционирования проходит параллельно поверхности сетчатки, идеально прорезая внутреннего ядерного слоя между горизонтальными клетками и клетками амакринных. Таким образом, горизонтальные срезы внешней сетчатки создаются, содержащие, на пресинаптической месте, фоторецепторов с внутренними и внешними сегментами, а также синаптических окончаний, а также горизонтальные клетки и биполярные клетки на постсинаптической месте. Этот препарат хорошо подходит тO исследовать скоординированные синаптические входы в горизонтальные дендриты клеток всеми колбочек фоторецепторов в пределах своей дендритных поля. Таким образом, она может оказаться полезным, чтобы лучше понять работу фоторецепторов лентой синапса, которая имеет решающее значение для передачи визуальной информации из матрицы активации фоторецепторов в постсинаптической ответ.

Protocol

Все процедуры были проведены в соответствии с руководящими принципами для экспериментов на животных, выданных Федеративной Республики Германии. Примечание: Поскольку ткань сетчатки будет лишен кислорода во время длительных частей этой процедуры все этапы должны выпо…

Representative Results

В горизонтальных срезов сетчатки мыши, горизонтальные клеточные тела могут быть легко идентифицированы в соответствии с их уникальной морфологии с несколькими первичными дендритов , выходящих из многоугольной тела клетки (рис 1А). Горизонтальные клеточн…

Discussion

В отличие от вертикальных срезов, дендритные морфология радиально ориентированных нейронов как горизонтальных клеток и клеток амакринных хорошо сохранились. По сравнению с целыми сетчатка препаратов, эти типы клеток легко доступны для микроэлектродов и могут быть изучены с помощью ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG FOR701 and FE464/11-1 to A.F. The authors want to acknowledge the excellent technical assistance of Andrea Nerz.

Materials

Ames' Medium Sigma A1420
Sodium Bicarbonate Sigma S5761
Hepes Sigma H3375
Carbogen Air Liquide
Agarose Sigma A9045
35-mm petri dish (plastic) Nunc Thermofisher 150318
Glass petri dish Chemoline 50-1470-40
Isoflurane Dispensary university hospital
Vibratome injector blade Biosystems 39053250
Vibratome Leica Microsystems VT1200
Vibrocheck Leica Microsystems
Microwave
Water bath
Forceps
20-gauge needles
Spring scissors
Curved scalpel blades
Stereo microscope
Plastic Pasteur pipette
Glass Pasteur pipette

References

  1. DeVries, S. H., Li, W., Saszik, S. Parallel processing in two transmitter microenvironments at the cone photoreceptor synapse. Neuron. 50, 735-748 (2006).
  2. Jackman, S. L., et al. Role of the synaptic ribbon in transmitting the cone light response. Nature Neuroscience. 12 (3), 303-310 (2009).
  3. Rabl, K., Cadetti, L., Thoreson, W. B. Kinetics of exocytosis is faster in cones than in rods. J. Neurosci. 25 (18), 4633-4640 (2005).
  4. Singer, J. H., Lassová, L., Vardi, N., Diamond, J. S. Coordinated multivesicular release at a mammalian ribbon synapse. Nature Neuroscience. 7 (8), 826-833 (2004).
  5. Peichl, L., González-Soriano, J. Morphological types of horizontal cell in rodent retinae: a comparison of rat, mouse, gerbil, and guinea pig. Vis. Neurosci. 11, 501-517 (1994).
  6. Ames, A., Nesbett, F. B. In vitro retina as an experimental model of the central nervous system. J. Neurochem. 37 (4), 867-877 (1981).
  7. Mathis, D. M., Furman, J. J., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. J. Vis. Exp. (49), (2011).
  8. Peichl, L., Sandmann, D., Boycott, B. B. Comparative anatomy and function of mammalian horizontal cells. Development of the Retina. , (1998).
  9. Feigenspan, A., Babai, N. Functional properties of spontaneous excitatory currents and encoding of light/dark transitions in horizontal cells of the mouse retina. Eur. J. Neurosci. 42 (9), 2615-2632 (2015).
  10. Enoki, R., Jakobs, T. C., Koizumi, A. Horizontal slice preparation of the retina. J. Vis. Exp. (1), e108 (2006).
  11. Babai, N., et al. Functional roles of complexin3 and complexin4 at mouse photoreceptor ribbon synapses. J. Neurosci. 36, 6651-6667 (2016).
  12. Thoreson, W. B. Horizontal slices of mouse retina expose horizontal cells and their properties (Commentary on Feigenspan & Babai). Eur. J. Neurosci. 42 (9), 2613-2614 (2015).

Play Video

Cite This Article
Feigenspan, A., Babai, N. Z. Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies. J. Vis. Exp. (119), e55173, doi:10.3791/55173 (2017).

View Video