إعداد شرائح أفقية من الكبار شبكية العين الفأر للدراسات الكهربية
Summary
وضعنا إعداد شريحة الأفقي للشبكية العين الكبار الثدييات مع الطائرة من باجتزاء موازية لسطح الشبكية. لم اقتطاع الحقول الجذعية من الخلايا العصبية للشبكية موجهة nonradially، والسماح للدراسة معالجة الإشارات مع تقنيات التصحيح، المشبك والتصوير.
Abstract
يتم وضع الاستعدادات شريحة رأسية أيضا لدراسة الدوائر ونقل الإشارات في الكبار شبكية الثدييات. الطائرة من باجتزاء في هذه الاستعدادات هي عمودي على سطح الشبكية، مما يجعلها مثالية لدراسة الخلايا العصبية الموجهة شعاعيا مثل خلايا مستقبلة للضوء والخلايا القطبين. ومع ذلك، فإن العرش شجيري كبيرة من الخلايا الأفقية، وخلايا عديم الاستطالات واسعة المجال، وخلايا العقدة هي في معظمها مبتورة، وترك انخفضت بشكل ملحوظ النشاط متشابك في هذه الخلايا. في حين أن خلايا العقدة والخلايا عديم الاستطالات المشردين يمكن دراستها في إعداد كله محمولة على شبكية العين، والخلايا الأفقية والخلايا عديم الاستطالات تقع في الطبقة النووية الداخلية يمكن الوصول إليها لأقطاب في أنسجة شبكية العين كلها سيئة فقط.
لتحقيق أقصى قدر من سهولة الوصول وسلامة متشابك، وضعنا إعداد شريحة الأفقي للشبكية العين الماوس، ودرس نقل الإشارات في المشبك بين خلايا مستقبلة للضوء والأفقيالخلايا. باجتزاء الأفقي يسمح (1) التعرف البصري سهلة واضح لا لبس فيه من أجسام الخلايا الأفقية لاستهداف الكهربائي، و (2) الحفاظ على حقول شجيري الخلايا الأفقية الممتدة، كشرط أساسي لحالها وظيفية مخروط مدخلات متشابك إلى التشعبات الخلية الأفقية.
الخلايا الأفقية من شرائح أفقية أظهرت النشاط متشابك منشط في الظلام، وأنها استجابت لإطلاع ومضات من الضوء مع الحد من الداخل النشاط متشابك الحالي وتقلص. تشير الأدلة Immunocytochemical أن ما يقرب من جميع المخاريط في مجال شجيري خلية الأفقية تضع نقاط الاشتباك العصبي مع التشعبات في الطرفية. لذلك مناسبة لإعداد شريحة الأفقي كذلك دراسة الخصائص الفسيولوجية للالخلايا العصبية للشبكية ممتدة أفقيا وكذلك نقل الإشارات الحسية والتكامل بين نقاط الاشتباك العصبي المحدد.
Introduction
يتم ترميز المعلومات البصرية كنمط الديناميكي المكانية والزمانية لتفعيل مبصرة، والمشبك الشريط بين خلايا مستقبلة للضوء والخلايا العصبية من الدرجة الثانية قرر نقل المصب من المعلومات البصرية. إعداد شريحة الرأسي للشبكية الثدييات هو أداة قيمة للغاية لدراسة معالجة الإشارات في مسارات العمودي، أي بين خلايا مستقبلة للضوء والخلايا القطبين، وبين خلايا ثنائية القطب وبعض أنواع الخلايا عديم الاستطالات 1، 2، 3، 4.
ومع ذلك، باجتزاء الرأسي يسبب دائما اقتطاع شديد في مجالات شجيري من العديد من الخلايا العصبية للشبكية، مما أدى إلى خسائر كبيرة في الاتصالات متشابك. خاصة في شبكية العين الخارجية، وتتأثر خلايا الأفقية بسبب حقول ممتدة تنتشر أفقيا على شجيري والنظم محطة محور عصبي 5. في رأسيوبالتالي انخفاض إعداد شريحة، ومدخلات متشابك من مئات المحطات مخروط مبصرة لالتشعبات خلية الأفقية على عدد قليل من الاتصالات متفرق. وهذا قد يكون كافيا لدراسة خصائص نقاط الاشتباك العصبي الفردية، ولكنها لا تمثل بأي حال من الأحوال قدرات معالجة الإشارات الكامنة وراء تفعيل متزامنة من نقاط الاشتباك العصبي مبصرة الشريط.
لذا قمنا بتطوير إعداد شريحة الأفقي، مما يترك ما يقرب من جميع مبصرة مخروط مدخلات متشابك إلى التشعبات الخلية الأفقية سليمة وظيفية. الطائرة من يدير باجتزاء موازية لسطح شبكية العين، وقطع مثالي من خلال طبقة النووية الداخلية بين الخلايا الأفقية والخلايا عديم الاستطالات. وهكذا، شرائح أفقية من شبكية العين الخارجي يتم إنشاؤها تحتوي، على الموقع قبل المشبكي، المستقبلات الضوئية مع قطاعات الداخلية والخارجية وكذلك محطات متشابك، والخلايا الأفقية وخلايا القطبين على الموقع بعد المشبكي. هذا المستحضر يناسب جيدا رس التحقيق مدخلات متشابك منسقة في التشعبات الخلية الأفقية جميع مبصرات مخروط داخل مجالها شجيري. ومن ثم قد تكون مفيدة لفهم أفضل للعمل من المشبك مستقبلة للضوء الشريط، وهو أمر حاسم لنقل المعلومات البصرية من المصفوفة تفعيل مستقبلة للضوء في استجابة بعد المشبكي.
Protocol
Representative Results
Discussion
وعلى النقيض من شرائح عمودية، مورفولوجيا شجيري من الخلايا العصبية الموجهة شعاعيا مثل الخلايا الأفقية وخلايا عديم الاستطالات والحفاظ عليها جيدا. مقارنة الاستعدادات شبكية العين بأكملها، هذين النوعين من الخلايا يمكن الوصول إليها بسهولة لالميكروية ويمكن دراستها م?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG FOR701 and FE464/11-1 to A.F. The authors want to acknowledge the excellent technical assistance of Andrea Nerz.
Materials
| Ames' Medium | Sigma | A1420 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | |
| Carbogen | Air Liquide | ||
| Agarose | Sigma | A9045 | |
| 35-mm petri dish (plastic) | Nunc Thermofisher | 150318 | |
| Glass petri dish | Chemoline | 50-1470-40 | |
| Isoflurane | Dispensary university hospital | ||
| Vibratome injector blade | Biosystems | 39053250 | |
| Vibratome | Leica Microsystems | VT1200 | |
| Vibrocheck | Leica Microsystems | ||
| Microwave | |||
| Water bath | |||
| Forceps | |||
| 20-gauge needles | |||
| Spring scissors | |||
| Curved scalpel blades | |||
| Stereo microscope | |||
| Plastic Pasteur pipette | |||
| Glass Pasteur pipette |
References
- DeVries, S. H., Li, W., Saszik, S. Parallel processing in two transmitter microenvironments at the cone photoreceptor synapse. Neuron. 50, 735-748 (2006).
- Jackman, S. L., et al. Role of the synaptic ribbon in transmitting the cone light response. Nature Neuroscience. 12 (3), 303-310 (2009).
- Rabl, K., Cadetti, L., Thoreson, W. B. Kinetics of exocytosis is faster in cones than in rods. J. Neurosci. 25 (18), 4633-4640 (2005).
- Singer, J. H., Lassová, L., Vardi, N., Diamond, J. S. Coordinated multivesicular release at a mammalian ribbon synapse. Nature Neuroscience. 7 (8), 826-833 (2004).
- Peichl, L., González-Soriano, J. Morphological types of horizontal cell in rodent retinae: a comparison of rat, mouse, gerbil, and guinea pig. Vis. Neurosci. 11, 501-517 (1994).
- Ames, A., Nesbett, F. B. In vitro retina as an experimental model of the central nervous system. J. Neurochem. 37 (4), 867-877 (1981).
- Mathis, D. M., Furman, J. J., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. J. Vis. Exp. (49), (2011).
- Peichl, L., Sandmann, D., Boycott, B. B. Comparative anatomy and function of mammalian horizontal cells. Development of the Retina. , (1998).
- Feigenspan, A., Babai, N. Functional properties of spontaneous excitatory currents and encoding of light/dark transitions in horizontal cells of the mouse retina. Eur. J. Neurosci. 42 (9), 2615-2632 (2015).
- Enoki, R., Jakobs, T. C., Koizumi, A. Horizontal slice preparation of the retina. J. Vis. Exp. (1), e108 (2006).
- Babai, N., et al. Functional roles of complexin3 and complexin4 at mouse photoreceptor ribbon synapses. J. Neurosci. 36, 6651-6667 (2016).
- Thoreson, W. B. Horizontal slices of mouse retina expose horizontal cells and their properties (Commentary on Feigenspan & Babai). Eur. J. Neurosci. 42 (9), 2613-2614 (2015).
