Summary

Dextran erhöht die Effizienz der Lentivirale Transduktion von murinen und menschliche primäre NK-Zellen

Published: January 15, 2018
doi:

Summary

Das Ziel dieser Studie war es, Technologien zu formulieren, die für erfolgreiche gen Transduktion in primären natürlichen killer (NK) Zellen ermöglichen. Die Dextran-vermittelten Lentivirale Transduktion von Mensch oder Maus primären NK Zellen führt zu höheren Wirkungsgraden der gen-Expression. Diese Methode des Gens Transduktion wird NK Zelle genetischen Manipulation erheblich verbessern.

Abstract

Die effizienteste Transduktion bestimmter Gene in natürlichen killer (NK)-Zellen ist eine große Herausforderung gewesen. Erfolgreiche Transductions sind entscheidend für die Bestimmung der Rolle des Gens von Interesse in der Entwicklung, Differenzierung und Funktion von NK-Zellen. Die jüngsten Fortschritte im Zusammenhang mit Chimären Antigen-Rezeptoren (Autos) im Krebsimmuntherapie betonen die Notwendigkeit für eine effiziente Methode zu exogenen Gene Effektor Lymphozyten liefern. Die Wirkungsgrade von Lentivirale vermittelte gen Transductions in primären Mensch oder Maus-NK-Zellen bleiben deutlich niedriger, was ein wichtiger begrenzender Faktor. Die jüngsten Fortschritte mit kationischen polymeren, z. B. Polybrene, zeigen eine verbesserte gen Transduktion Effizienz in T-Zellen. Doch scheiterte dieser Produkte, die Transduktion Wirkungsgrade von NK-Zellen zu verbessern. Diese Arbeit zeigt, dass Dextran, verzweigte Glucan Polysaccharid, verbessert erheblich die Transduktion Effizienz von Mensch und Maus primären NK-Zellen. Dieser hoch reproduzierbare Transduktion Methodik bietet ein kompetenter Werkzeug für transducing menschliche primäre NK-Zellen, die klinischen gen Lieferung Anwendungen und somit NK-Zell-basierte Krebs-Immuntherapie. erheblich verbessern können

Introduction

Natürliche killer (NK)-Zellen sind die großen lymphatischer Bevölkerung des angeborenen Immunsystems1. NK-Zellen fungieren als Erstlinien Verteidiger der Host Immunantwort gegen Tumoren und Infektionen2,3,4. NK-Zellen spielen auch eine zentrale Rolle bei der Entwicklung der Toleranz durch die Sekretion von potenten Zytokine und Chemokine5. Aufgrund ihrer starken Fähigkeit, gezielt zu beseitigen Tumorzellen werden mehrere klinische Studien durchgeführt, um Spender-abgeleitete menschliche NK-Zellen als eine Adoptive Immuntherapie bei Krebs6,7zu bewerten. Im Gegensatz zu T-Zellen muss der Entwicklungsbiologie von NK-Zellen noch gut charakterisierten8. Diese Unkenntnis ist teilweise wegen fehlender effizienter Techniken, die Gene von Interesse an Maus oder menschliche primäre NK-Zellen zu liefern. Aus diesen Gründen haben die meisten NK-Zell in Zell-Linien, anstatt in Primärzellen Studien. Daher ist die Notwendigkeit für ein zuverlässiges und effizientes Protokoll zum primären NK-Zellen mit Genen von Interesse transduzieren entscheidend.

Das übergeordnete Ziel dieser Studie war es, eine konsistente und zuverlässige Methode zu formulieren, mit der primären menschlichen oder murine NK-Zellen mit Lenti oder Retroviren ausgestrahlt werden könnte.

Frühere Studien, die versuchten, dieses Problem zu beheben wurden durchgeführt, weitgehend über die vorübergehende Umwandlung von primären NK-Zellen. Dazu gehören Plasmid Transfektion9,10, Epstein – Barr-Virus (EBV) / retrovirale Hybrid Vektor11, “Vaccinia” Vektoren12,13und Ad5/F35 Chimären adenovirale Vektoren14. Trotz der bescheidenen Wirkungsgrad dieser Techniken macht die vergängliche Natur der Transduktion sie ungeeignet für die langfristige Nutzung von gentechnisch veränderten NK-Zellen. Einige neuere Studien haben retrovirale Vektoren verwendet, um transduzieren NK-Zellen, erfordern mehrere Zyklen der Infektion auf ein akzeptables Niveau der gen-Expression-11,15zu erreichen. Im Gegensatz zur retroviralen Vektoren können Lentivirale Vektoren Wirtszelle nuclear Import Maschinen die virale Vorintegration Komplex translozieren in den Zellkern. Dies ist ein großer limitierender Faktor bei der Replikation des Virus in nicht-teilenden Zellen, die primäre NK-Zellen enthalten.

Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Rezeptoren der Zelloberfläche und virale Partikel erlauben virale Aufnahme in die Zelle. Die ersten Kämpfe zwischen der Virushülle Proteine und ihre Verwandten Host-Rezeptoren könnte wegen der potenziellen negativen Ladungen zwischen diesen beiden bestehenden beschränkt werden. Das Grundprinzip hinter vielen Transduktion Techniken ist, dass die Zugabe von kationischen polymeren, z. B. Polybrene (Pb), Protamin Sulfat (PS) oder Dextran, könnte eine positive Ladung an die Rezeptoren der Zelloberfläche und damit die Bindung der Virushülle ergänzen Proteine. Dies erhöht die Fusion-Effizienz und die Aufnahme der viralen Partikel von den Zellen16. Obwohl es berichtet wurde, dass Pb oder PS Gentransfer in T Zellen17verbessern kann, ihre Anwendung nicht in die Transduktion Effizienz der primären NK-Zellen auswirken. Darüber hinaus wurde eine vergleichende Analyse zwischen dieser Reagenzien mit primären NK-Zellen nicht durchgeführt. In dieser Studie wurden die Transduktion Wirkungsgrade der drei kationische Polymere verglichen. Die Ergebnisse zeigen, dass unter diesen drei kationischen polymeren nur Dextran effiziente virale Transduktion in Maus und menschliche primäre NK-Zellen deutlich erhöht.

Protocol

Alle tierischen Protokolle folgten die humane und ethische Behandlung der Tiere und durch die institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) in Biomedical Research Center (BRC) des Medical College of Wisconsin (MCW), Milwaukee, WI angenommen wurden. Die Verwendung von menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) wurde durch die institutionelle Review Board (IRB) des Blut-Forschungsinstituts der Blut von Wisconsin, Milwaukee, WI genehmigt. (1) Mäuse, Zell-Linien und Vekto…

Representative Results

Dextran induziert die effiziente Gentransfer Lentivirale Vektor in primären menschlichen und murinen NK-Zellen Menschlichen NK-Zellen wurden isoliert und gereinigt von PBMC (mit einer Reinheit von mehr als 85 %) und über Nacht mit rIL-2 300 U/mL inkubiert. Diese primäre NK-Zellen wurden dann mit GFP Lentivirus am abwechslungsreichen Mannigfaltigkeiten der Infektion ausgestrahlt (MOI; 3, 10 und 20 IU pro Zelle) in 24-Well-Platten…

Discussion

Diese Studie zeigt, dass die Verwendung von Dextran als ein kationisches Polymer-Agent die Lentivirale Transduktion Effizienz der murinen und menschliche primäre NK-Zellen verbessert. Darüber hinaus haben andere kationische Mittel, wie Pb oder PS, keinen erkennbaren Einfluss auf die Lieferung von viralen Vektoren in menschliche primäre NK-Zellen. Zuvor wurde nachgewiesen, dass Pb gen Transduktion in menschlichen T-Zellen-17ergänzen kann. Diese Ergebnisse zeigen jedoch, dass weder Pb noch PS ei…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Lucia Sammarco und ihr Lulus Lemonade Stand für Inspiration, Motivation und Unterstützung. Diese Arbeit wurde zum Teil durch NIH R01 AI102893 und NCI R01 CA179363 (S.M) unterstützt; NHLBI-HL087951 (S.R.); NIH-CA151893-K08 (M.J.R.); NCI-1R01CA164225 (L.W); der Alex Lemonade Stand Foundation (S.M.); Das HRHM-Programm des MACC Fonds (S.M.; S.R.; M.S.T); die Nikolaus-Familienstiftung (S.M.); Gardetto Familie (S.M.); die Hyundai-Gelehrten Programm (M.S.T.); Hyundai Hoffnung auf Rädern (S.R.); die MACC-Fonds (M.S.T. und S.M.); die Kinder-Forschungsinstitut, MCW (S.R.); und Kathy Duffey Fogerty Award (M.J.R.).

Materials

Dextran Sigma-Aldrich 90-64-91-9
polybrene (Pb) Sigma-Aldrich TR-1003
protamine sulfate (PS) Sigma-Aldrich p3369
Trypsin Corning 25-052-CI
RPMI1640 Corning 10-040-CV
Fetal Bovine Serum ATALANTA S11150
Penicillin Corning 30-001-CI
B-mercaptoethanol SIGMA M3148
sodium pyruvate Corning MT25000CI
Interferon gamma (IFN-γ ) eBioscience 14-7311-85
Propidium lodding staining solution BD 51-66211E
Lipofectamine 3000 Thermo Fisher L3000015
Isoflurane PHOENIX NDC 57319-559-05
NK cell negative selection kit Stem Cell 19855
Yac-1 ATCC TIB-160
K562 ATCC CCL-243
Mice Jakson 664
293T cells ATCC CRL-3216
T75 flasks Cornnig 430641U
antibody-based negative selection kits Stem Cell 19055
51Chromium (Cr)-release assays perkin elmer's NEZ030
ELISA kits Ebioscience 00-4201-56
Sodium Butyrate Sigma 5887-5G
Linear polyethylenimine polysciences 23966-2
Ficoll GE Life Science 17-1440-03
HBSS Corning 21-022-CV

References

  1. Vivier, E., Tomasello, E., Baratin, M., Walzer, T., Ugolini, S. Functions of natural killer cells. Nat. Immunol. 9, 503-510 (2008).
  2. Zitvogel, L., Tesniere, A., Kroemer, G. Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunosubversion. Nat. Rev. Immunol. 6, 715-727 (2006).
  3. Arina, A., et al. Cellular liaisons of natural killer lymphocytes in immunology and immunotherapy of cancer. Expert. Opin. Biol. Ther. 7, 599-615 (2007).
  4. Manilay, J. O., Sykes, M. Natural killer cells and their role in graft rejection. Curr. Opin. Immunol. 10, 532-538 (1998).
  5. Raulet, D. H., Vance, R. E. Self-tolerance of natural killer cells. Nat. Rev. Immunol. 6, 520-531 (2006).
  6. Chouaib, S., et al. Improving the outcome of leukemia by natural killer cell-based immunotherapeutic strategies. Front Immunol. 5, 95 (2014).
  7. Dulphy, N., et al. Underground Adaptation to a Hostile Environment: Acute Myeloid Leukemia vs. Natural Killer Cells. Front Immunol. 7, 94 (2016).
  8. Tran, J., Kung, S. K. Lentiviral vectors mediate stable and efficient gene delivery into primary murine natural killer cells. Mol. Ther. 15, 1331-1339 (2007).
  9. Maasho, K., Marusina, A., Reynolds, N. M., Coligan, J. E., Borrego, F. Efficient gene transfer into the human natural killer cell line, NKL, using the Amaxa nucleofection system. J. Immunol. Methods. 284, 133-140 (2004).
  10. Trompeter, H. I., Weinhold, S., Thiel, C., Wernet, P., Uhrberg, M. Rapid and highly efficient gene transfer into natural killer cells by nucleofection. J. Immunol. Methods. 274, 245-256 (2003).
  11. Becknell, B., et al. Efficient infection of human natural killer cells with an EBV/retroviral hybrid vector. J. Immunol. Methods. 296, 115-123 (2005).
  12. Jiang, K., et al. Syk regulation of phosphoinositide 3-kinase-dependent NK cell function. J. Immunol. 168, 3155-3164 (2002).
  13. Burshtyn, D. N., et al. Conserved residues amino-terminal of cytoplasmic tyrosines contribute to the SHP-1-mediated inhibitory function of killer cell Ig-like receptors. J. Immunol. 162, 897-902 (1999).
  14. Schroers, R., et al. Gene transfer into human T lymphocytes and natural killer cells by Ad5/F35 chimeric adenoviral vectors. Exp. Hematol. 32, 536-546 (2004).
  15. Imai, C., Iwamoto, S., Campana, D. Genetic modification of primary natural killer cells overcomes inhibitory signals and induces specific killing of leukemic cells. Blood. 106, 376-383 (2005).
  16. Denning, W., et al. Optimization of the transductional efficiency of lentiviral vectors: effect of sera and polycations. Mol. Biotechnol. 53, 308-314 (2013).
  17. Lamers, C. H., Willemsen, R. A., Luider, B. A., Debets, R., Bolhuis, R. L. Protocol for gene transduction and expansion of human T lymphocytes for clinical immunogene therapy of cancer. Cancer Gene Ther. 9, 613-623 (2002).
  18. Campeau, E., et al. A versatile viral system for expression and depletion of proteins in mammalian cells. PLoS. ONE. 4, e6529 (2009).
  19. Segura, M. M., Garnier, A., Durocher, Y., Ansorge, S., Kamen, A. New protocol for lentiviral vector mass production. Methods Mol. Biol. 614, 39-52 (2010).
  20. Rajasekaran, K., et al. Signaling by Fyn-ADAP via the Carma1-Bcl-10-MAP3K7 signalosome exclusively regulates inflammatory cytokine production in NK cells. Nat. Immunol. 14, 1127-1136 (2013).
  21. Regunathan, J., Chen, Y., Wang, D., Malarkannan, S. NKG2D receptor-mediated NK cell function is regulated by inhibitory Ly49 receptors. Blood. 105, 233-240 (2005).
  22. Awasthi, A., et al. Rap1b facilitates NK cell functions via IQGAP1-mediated signalosomes. J. Exp. Med. 207, 1923-1938 (2010).
  23. Rajasekaran, K., et al. Transforming Growth Factor-{beta}-activated Kinase 1 Regulates Natural Killer Cell-mediated Cytotoxicity and Cytokine Production. J Biol. Chem. 286, 31213-31224 (2011).
  24. Wolkowicz, R., Nolan, G. P., Curran, M. A. Lentiviral vectors for the delivery of DNA into mammalian cells. Methods Mol. Biol. 246, 391-411 (2004).
  25. Sutlu, T., et al. Inhibition of intracellular antiviral defense mechanisms augments lentiviral transduction of human natural killer cells: implications for gene therapy. Hum. Gene Ther. 23, 1090-1100 (2012).
  26. Cornetta, K., Anderson, W. F. Protamine sulfate as an effective alternative to polybrene in retroviral-mediated gene-transfer: implications for human gene therapy. J. Virol. Methods. 23, 187-194 (1989).
  27. Toyoshima, K., Vogt, P. K. Enhancement and inhibition of avian sarcoma viruses by polycations and polyanions. Virology. 38, 414-426 (1969).
  28. Jensen, M., et al. The bi-specific CD3 x NCAM antibody: a model to preactivate T cells prior to tumour cell lysis. Clin. Exp. Immunol. 134, 253-263 (2003).

Play Video

Cite This Article
Nanbakhsh, A., Best, B., Riese, M., Rao, S., Wang, L., Medin, J., Thakar, M. S., Malarkannan, S. Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells. J. Vis. Exp. (131), e55063, doi:10.3791/55063 (2018).

View Video