Summary

Destrano migliora l'efficienza di trasduzione lentivirale di cellule NK primarie Murine ed umane

Published: January 15, 2018
doi:

Summary

L’obiettivo di questo studio era quello di formulare le tecnologie che permettono per la trasduzione del gene successo in primarie cellule natural killer (NK). La trasduzione lentivirale destrano-mediata di umani o risultati primari di cellule NK del mouse in una maggiore efficienza di espressione genica. Questo metodo di trasduzione del gene migliorerà notevolmente la manipolazione genetica delle cellule NK.

Abstract

La trasduzione efficiente di specifici geni in cellule natural killer (NK) è stata una sfida importante. Trasduzioni successo sono fondamentali per definire il ruolo del gene di interesse per lo sviluppo, la differenziazione e la funzione delle cellule NK. Gli avanzamenti recenti legati ai recettori chimerici antigene (automobili) nell’immunoterapia del cancro accentuano la necessità di un metodo efficiente trasportare geni esogeni di linfociti effettori. Le efficienze di trasduzioni lentivirali-mediata del gene in primari umani o cellule NK del mouse rimangano significativamente basse, che è un importante fattore limitante. Gli avanzamenti recenti utilizzando polimeri cationici, quali polybrene, mostrano un’efficienza di trasduzione migliorata gene in cellule di T. Tuttavia, questi prodotti non è riuscito a migliorare l’efficienza di trasduzione delle cellule NK. Questo lavoro mostra che destrano, un polisaccaride ramificato glucano, migliora notevolmente l’efficienza di trasduzione dell’essere umano e cellule NK primarie del topo. Questa metodologia di trasduzione altamente riproducibili fornisce uno strumento competente per trasdurre umano primarie cellule NK, che possono migliorare notevolmente le applicazioni cliniche gene consegna e così immunoterapia dei tumori basati su cellule NK.

Introduction

Cellule natural killer (NK) sono la popolazione linfocitaria principale del sistema immunitario innato1. Le cellule NK funzionano come i difensori di prima linea della risposta immunitaria contro i tumori e infezioni2,3,4. Le cellule NK svolgono un ruolo centrale nello sviluppo di tolleranza attraverso la secrezione di potenti citochine e chemochine5. Grazie alla loro potente capacità di mirare ed eliminare le cellule tumorali, test clinici multipli vengono condotte per valutare donatore-derivati di cellule NK umane come un’immunoterapia adottiva per cancro6,7. Contrariamente alle cellule di T, la biologia dello sviluppo delle cellule di NK ha ancora essere ben caratterizzati8. Questa mancanza di conoscenza è parzialmente dovuto alla mancanza di tecniche efficienti che consegnare i geni di interesse al mouse o cellule NK primarie. Per questi motivi, la maggior parte delle cellule NK studi condotti in linee cellulari, piuttosto che in cellule primarie. Pertanto, la necessità di un protocollo affidabile ed efficiente di trasdurre primarie cellule NK con geni di interesse è fondamentale.

L’obiettivo generale di questo studio era di formulare un metodo coerente e affidabile con cui le cellule NK umane o murine primarie potrebbero essere trasdotte con lenti – o retrovirus.

Sono stati effettuati studi precedenti che hanno tentato di risolvere questo problema, in gran parte utilizzando la trasformazione transitoria primarie delle cellule di NK. Questo include il plasmide transfezione9,10, Virus di Epstein – Barr (EBV) / ibrido retroviral vector11, vaccinia virus file vettoriale12,13e Ad5/F35 vettori adenovirali chimerico14. Nonostante la modesta efficienza di queste tecniche, la natura transitoria della trasduzione li rende inadatti per l’utilizzo a lungo termine delle cellule NK geneticamente modificate. Alcuni studi recenti hanno utilizzato vettori retrovirali trasduce le cellule NK, che richiedono più cicli di infezione per raggiungere un livello accettabile di espressione genica11,15. In contrasto con vettori retrovirali, vettori lentivirali possono utilizzare macchinari di importazione nucleare cellula ospite per il complesso di pre-integrazione virale di traslocano nel nucleo. Si tratta di un importante fattore limitante nella replicazione del virus nelle cellule di divisione, che comprendono le cellule NK primarie.

Interazioni tra diversi recettori della superficie cellulare e particelle virali consentono l’assorbimento virale nella cellula. L’iniziali impegni fra le proteine dell’envelope virale ed i loro ricevitori cognate host potrebbero essere limitati a causa del potenziale cariche negative esistenti tra questi due. La spiegazione razionale dietro molte tecniche di trasduzione è che l’aggiunta di polimeri cationici, quali polybrene (Pb), solfato di protamina (PS) o destrano, potrebbe dare una carica positiva per i recettori della superficie cellulare e quindi aumentare l’associazione dell’envelope virale proteine. Ciò aumenterà l’efficienza di fusione e l’assorbimento delle particelle virali dai cellule16. Anche se è stato segnalato che Pb o PS può migliorare il trasferimento genico in cellule T17, loro applicazione non ha alcun effetto dell’efficienza di trasduzione delle cellule NK primarie. Inoltre, non è stata eseguita un’analisi comparativa tra questi reagenti utilizzando cellule NK primarie. In questo studio, sono state confrontate le efficienze di trasduzione dei tre polimeri cationici. I risultati mostrano che, tra questi tre polimeri cationici, solo destrano migliora significativamente efficiente trasduzione virale in cellule NK primarie sia il mouse.

Protocol

Tutti i protocolli degli animali ha seguito il trattamento umano ed etico degli animali e sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) all’interno di centro di ricerca biomedica (BRC) del Medical College of Wisconsin (MCW), Milwaukee, WI. L’uso delle cellule mononucleari del sangue periferico umano (PBMC) è stato approvato da istituzionale Review Board (IRB) dell’Istituto di ricerca sangue sangue centro di Wisconsin, Milwaukee, WI. 1. topi, linee cellulari e vettor…

Representative Results

Destrano induce il trasferimento del gene efficiente del vettore lentivirale in cellule NK primarie umane e murine Cellule NK umane erano isolate e purificate da PBMC (con una purezza superiore al 85%) e incubate durante la notte con rIL-2 300 U/mL. Queste cellule NK primarie erano quindi trasdotte con lentivirus GFP a variegata molteplicità di infezione (MOI; 3, 10 e 20 UI per cella) in piastre da 24 pozzetti in presenza di 8 µ …

Discussion

Questo studio dimostra che l’uso di destrano come un agente di polimero cationico migliora l’efficienza di trasduzione lentivirale sia murine ed umane primarie delle cellule di NK. Inoltre, altri agenti cationici, quali Pb o PS, non avere alcun effetto visibile sulla fornitura di vettori virali in cellule NK primarie. In precedenza, è stato dimostrato che il Pb può aumentare trasduzione del gene umano di cellule T17. Questi risultati, tuttavia, indicano che Pb né PS hanno una simile efficienza …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo Lucia Sammarco e sua Lulu limonata Stand per ispirazione, motivazione e supporto. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da NIH R01 AI102893 e NCI R01 CA179363 (S.M.); NHLBI-HL087951 (S.R.); NIH-CA151893-K08 (M.J.R.); NCI 1R01CA164225 (L.W); l’Alex Lemonade Stand della Fondazione (S.M.); il programma HRHM del fondo MACC (S.M.; S.R.; MANGIAGLI); la Fondazione di famiglia Nicholas (S.M.); la famiglia Gardetto (S.M.); gli studiosi di Hyundai programmare (M.S.T); Hyundai speranza su ruote (S.R.); il fondo MACC (M.S.T e S.M.); Istituto di ricerca dei bambini, MCW (S.R.); e il premio di Kathy Duffey Fogerty (M.J.R.).

Materials

Dextran Sigma-Aldrich 90-64-91-9
polybrene (Pb) Sigma-Aldrich TR-1003
protamine sulfate (PS) Sigma-Aldrich p3369
Trypsin Corning 25-052-CI
RPMI1640 Corning 10-040-CV
Fetal Bovine Serum ATALANTA S11150
Penicillin Corning 30-001-CI
B-mercaptoethanol SIGMA M3148
sodium pyruvate Corning MT25000CI
Interferon gamma (IFN-γ ) eBioscience 14-7311-85
Propidium lodding staining solution BD 51-66211E
Lipofectamine 3000 Thermo Fisher L3000015
Isoflurane PHOENIX NDC 57319-559-05
NK cell negative selection kit Stem Cell 19855
Yac-1 ATCC TIB-160
K562 ATCC CCL-243
Mice Jakson 664
293T cells ATCC CRL-3216
T75 flasks Cornnig 430641U
antibody-based negative selection kits Stem Cell 19055
51Chromium (Cr)-release assays perkin elmer's NEZ030
ELISA kits Ebioscience 00-4201-56
Sodium Butyrate Sigma 5887-5G
Linear polyethylenimine polysciences 23966-2
Ficoll GE Life Science 17-1440-03
HBSS Corning 21-022-CV

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Nanbakhsh, A., Best, B., Riese, M., Rao, S., Wang, L., Medin, J., Thakar, M. S., Malarkannan, S. Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells. J. Vis. Exp. (131), e55063, doi:10.3791/55063 (2018).

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