Summary

בחיי עיר זיהוי, כימות תא בודד של תחמוצת מתכת חלקיקים באמצעות ניתוח Microprobe גרעיני

Published: February 03, 2018
doi:

Summary

אנו מתארים הליך איתור אלמנטים כימיים נוכח באתרו בתוך התאים של האדם, כמו גם שלהם כימות במבחנה . השיטה הוא מתאים היטב לכל סוג התא, שימושי במיוחד עבור בדיקות כימיות כמותית של תאים בודדים בעקבות במבחנה חשיפה חלקיקי תחמוצת מתכת.

Abstract

טכניקות אנליטיות מיקרו מבוסס על יסוד כימי הדמיה לאפשר לוקליזציה כימות של ההרכב הכימי ברמה התאית. הם מציעים אפשרויות חדשות עבור אפיון מערכות החיים, מתאימים במיוחד עבור איתור, לוקליזציה של לכימות הנוכחות של חלקיקי תחמוצת מתכת הן הביולוגיים והן את הסביבה. אכן, כל הטכניקות הללו עומד בדרישות רלוונטי מבחינת רגישות (i) (מ 1 עד 10 µg.g-1 של המוני יבש), והרזולוציה המרחבית של טווח מיקרומטר (ii) ו- (iii) רכיבים מרובים זיהוי. לאור מאפיינים אלה, microbeam יסוד כימי הדמיה ניתן בעוצמה משלימים טכניקות הדמיה שגרתיות כגון אופטי ומיקרוסקופיה זריחה. פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע ניתוח microprobe גרעיני תאים בתרבית (U2OS) נחשפים טיטניום דיאוקסיד חלקיקים. התאים חייב לצמוח, להיחשף ישירות בעל מדגם שתוכנן במיוחד נעשה שימוש במיקרוסקופ אופטי, בשלבי ניתוח microprobe גרעינית. מים עמוקים-הקפאה קריוגני קיבעון של הדגימות שומרת על הארגון הסלולר והן את התפלגות יסוד כימי. Microprobe גרעיני סימולטני ניתוח (סריקה שידור יון מיקרוסקופ, מסות backscattering רתרפורד, החלקיקים הנגרמת שקרינת x) המבוצעת על הדגימה מספק מידע אודות הסלולר צפיפות, התפלגות מקומי יסודות כימיים, כמו גם את תוכן סלולרי חלקיקים. יש צורך הולך וגדל כלים אנליטיים כאלה בתוך הביולוגיה, במיוחד בהקשר המתעוררים של ננו טוקסיקולוגיה, ננו-רפואה אשר חייב להיות העמיקה הבנתנו של אינטראקציות בין חלקיקים דגימות ביולוגיות. בפרט, כפי microprobe גרעיני ניתוח אינה דורשת חלקיקים כדי להיות מתויג, ננו-חלקיק abundances הם לכימות עד לרמת תא בודד בקרב אוכלוסיה תא, ללא תלות במצבן משטח.

Introduction

הומאוסטזיס הסלולר נקבעת על ידי ספיגת שליטה, הטמעה, לוקליזציה תאיים של יסודות קורט שונים (יונים, מתכות, חומרים אורגניים נדיפים אקסוגני). רכיבים אלה הם לעתים קרובות בצורה של עקבות, אבל בכל זאת עשוי להיות בעל השפעה ניכרת בפיזיולוגיה המערכת. לפיכך, המחקר של ביוכימיה התא במצבים רגילים והן הפתולוגיים/הדגיש היא צעד המפתח לקראת הבנה כללית של המנגנונים התאיים מטבולית. לכן, התפתחות טכניקות הדמיה אנליטיים שמאפשר חקירת תאיים abundances כימיים, הארגון מבניים, פונקציות מטבוליות הקשורות שלהם הופך להיות הכרחי. שיטות מעט מאוד מסוגלים לספק בחיי עיר כמותיים פיסת מידע הנוגע לטבעו כימי הכולל של דגימה נתון. מלבד שיטות ניתוח דגימות בצורה גורפת, ניתוחים בחיי עיר לשקול דגימות ביולוגיות ב integrality שלהם מבלי לאבד מידע בנפח גדול ומבניים, ובכך לשמר שלהם כימיקלים המרכיבים אותה (יסודות קורט, יונים), חלבונים. יתר על כן, כמו ננוטכנולוגיה להמשיך לפתח, הדמיה משופר ושיטות אנליטיות ניטור סביבתי את המשקל הסלולר יהיה צורך להתבונן ולכמת ננו-אובייקט התנהגויות ואינטראקציות. 1

חלקיקים (NPs) הוגדרו כאובייקטים מפגין הממד פנים אחד לפחות ב- טווח 1 ל- 100 ננומטר. 2 בשל תכונותיהם physicochemical מסוים, NPs נמצאים בשימוש נרחב בתעשייה. NPs מועסקים ביו-יישומים, ננו-רפואה. 3 , 4 למרות המאפיינים physicochemical רבים של NPs, הם עשויים ליצור כמה סיכונים של השפעות שליליות על בריאות האדם והסביבה. סיכונים אלה יכולה להיגרם על ידי חשיפות ממושכות והן חוזרות ברמות ריכוז שונים, זה לא עדיין בבירור הקימה. 5 , 6 , 7 , 8 בפרט, גורלו של NPs בתוך התאים ואת התגובות הסלולר משויכים הם, עד כה, לא לגמרי תיאר. . זאת בחלקו בשל המחסור שיטות המאפשרות זיהוי, כימות של NPs למביטה בתא יחיד. 9

כלים אנליטיים קלאסית המשמש להערכת המינון הסלולר של חלקיקים הם microscopies, ספקטרומטר מסה (MS), מצמידים inductively פלזמה MS (ICP-MS)10,11 ו כרומטוגרפיה נוזלית ש-MS (LC-MS), אבל הם מספקים רק מידע שימושי על הסולם מאקרוסקופית. אף אחד מהם לא יכול לספק הערכה מדויקת של התוכן NPs subcellular או ההתפלגות NPs ללא השימוש בשיטות fractionation. הערכה שיטתית של המנה-תגובה ולכן בלתי אפשרי באמצעות שיטות אלה, לעומת שיטות בהתבסס על ספקטרוסקופיה אטומית כגון גרעיני microprobe ניתוח12,13, סינכרוטרון רנטגן פלורסצנטיות מיקרוסקופ14 , ויון משני ספקטרומטר מסה (SIMS). 15 , 16 שיטות אלה הינם מעניינים במיוחד הם משלימים את תצפיותיו באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות, בייחוד כאשר NPs לא יכול להיקרא עם מולקולות פלורסנט נלמדים ובכך במצבם המקורי. במידה מסוימת, אפילו כאשר NPs מורכבים עם fluorophores, (i) כימות נשאר קשה כי רמת תיוג לכל NP אינו ידוע (ii) שינוי כימי של המשטח NP רשאית לשנות תפוצתו הסלולר.

במאמר זה, אנו מתמקדים שיטה המבוססת על שילוב של טכניקות microprobe גרעיני מכוון הדמיה של מורפולוגיה הרכב היסודות של דגימות ביולוגיות בלה מז’ור, מינור, ולאתר ריכוזים.

ניתוח microprobe גרעיני מוכיחה להיות מתאים במיוחד עבור המידה של יסודות כימיים קורט ברקמות ביולוגיות. רזולוציה לרוחב הקורה (0.3 עד 1 מיקרומטר) והן רגישות בזיהוי יסוד כימי (מ 1 עד 10 µg.g-1 יבש מסה) מתאימים היטב מחקרים ברמה התאית. Microprobe גרעיני טכניקות מבוססים על זיהוי החלקיקים (פוטונים, אלקטרונים, יונים) הנפלטים אחרי קרן יון (ריצה בדרך כלל על תהליך אנרגיות) אינטראקציה עם אטומים נוכח במדגם. אינטראקציות המתרחשים בתאים הם בעיקר: 1) עירור/יינון של אטומים ואחריו של פליטת פוטונים לאחר אטומים להחזיר למצב היסוד שלהם; ו- 2) דיפוזיה של חלקיקים נכנסות מובילים כדי לשנות את האנרגיה שלהם, כיוון. מדידת חלקיקים הנפלטים אנרגיה allowsthe זיהוי של אטומים המעורבים באינטראקציה. כדי לבצע מיפוי של רכיבי, microbeam יון שוב ושוב נסרק על פני מדגם, לעיתים קרובות על פני שטח של-100 מיקרומטר 1002 המכיל מספר תאים. חלקיקים הנפלטים מזוהים, האנרגיה שלהם נרשם לכל תפקיד קרן. מיון החלקיקים בהתאם למיקום קרן, ולכן זיהוי המבנה אחראי הפליטה של חלקיקים כאלה היא המטרה של הטיפול נתונים. כאן, אנו מתארים בדיוק גישה המבוססת על קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ וניתוח microprobe גרעיני כדי לאתר, כמו גם לכמת NPs אקסוגני על המאזניים הסלולר וסלולריות תת, במטרה לחקור את ההשלכות של NP אינטראקציות עם החיים מערכות. במיוחד נתמקד ההזדמנויות המוצעים על ידי שיטה זו מבחינת בחיי עיר כימות של אגרגטים טיטניום דיאוקסיד חלקיקים (TiO2 NPs) ברמת subcellular.

Protocol

1. מחזיק קליניים מדגם בעל עיצוב והכנת ייצור בעל מדגם על ידי קידוח ריבוע 5 מ מ x 5 מ מ בתוך מסגרת הצצה בעובי 1 מ מ. נקי על ידי שטיפה עם אתנול 70% (v/v) ולשמור על צלחות סטרילי עד מוכן לשימוש.רומן בעל מדגם מתאים תרבית תאים וטיפול תא נדרש. זה צריך להיות מתוכנן עבור תא culturing, תצפ…

Representative Results

תרבית תאים והדימות זריחה של TiO שכותרתו fluorescently 2 NPs תיכננו בעל מדגם מותאם תרבית תאים, תא טיפול, כמו גם ניתוח עם מודאלים מרובים. באופן ספציפי, היה חשוב כי בעל מותר מיקרוסקופ אופטי שגרתיות כמו טוב כמו גרעיני micr…

Discussion

אנו מתארים שיטה המספקת מידע שימושי מעבר מה אפשרי עם טכניקות הדמיה אחרות, במיוחד ברמה subcellular. בנוסף יכולת הדמיה, ניתוח microprobe גרעיני מציע גם אפשרויות של כימות של יסודות כימיים הזנת בהרכב של דגימה ביולוגית. בשנת העבודה הנוכחית, אנו למד אוכלוסיות תאים אנושיים, ממוקד עד הניתוח של אזור שבחרת עניי…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים Borderes סרג בימוי ועריכה של הוידאו. הסוכנות למחקר לאומי צרפתי תומך בתוכנית מחקר TITANIUMS (ANR CES 2010, n ° CESA 009 01). ה-CNRS הקהילה האירופית כפעילות בשילוב מסופקים “תמיכה של הציבור, תעשייתי המחקר באמצעות יון קרן טכנולוגיה (הרוח) תחת EC החוזה n ° 227012. עבודה זו היא נתמכה על ידי מארי קירי פעולות – רשתות ההכשרה הראשונית (ITN) כמו שילוב פעילות תמיכה לתארים מתקדמים מחקר עם התמחות בתעשייה, הדרכה מצויינות”(ספרייט, D1.3) תחת חוזה EC מס 317169. Sud Ouest גרנד את C’NANO של אקיטן אזור תמיכה את תוכנית המחקר רעלים-ננו (n ° 20111201003), את תוכנית המחקר POPRA (n ° 14006636-034).

Materials

Cell culture
U2OS ATCC, LGC STANDARDS ATCC HTB-96
Medium MCCOY 5A w/o L-Glutamine Dominique DUTSCHER L0211-500
FBS 500 mL Dominique DUTSCHER 500105U
Penicillin/Streptomycin  ThermoFisher Scientific 11548876
 L-Glutamine 200 mM, 100 mL  Invitrogen 25030024
Geneticin,  20 mL ThermoFisher Scientific 10092772
Trypsin-EDTA 0.25% (v/v)  500 mL ThermoFisher Scientific 11570626
Viromer Red Lipocalyx VR-01LB-01
Matrix-roGFP Plasmid AddGene #49437
Hoechst 33342 ThermoFisher Scientific H3570 Handle with care
NPs preparation
TiO2 P25 AEROXIDE Degussa/Evonik
Tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) SIGMA-ALDRICH T3163 Surface modification of NPs
Sample preparation
Polycarbonate foil Goodfellow CT301020
Polyether Ether Ketone support (PEEK) Matechplast A-239-4047
Ethanol, ACS absolute SIGMA-ALDRICH 02860-6x1L
Chlorform, Anhydrous, 99% SIGMA-ALDRICH 372978-1L  Caution toxic
Formvar 100 g Agar Scientific AGR1201 Harmful. Use in a concentration of 10 µg per mL of chloroform
NaOH SIGMA-ALDRICH S5881-500G
Sample fixation
Powder, 95% Paraformaldehyde SIGMA-ALDRICH 158127-500G Caution toxic. Use as a 4% solution in PBS
PBS (pH 7.4, without Ca2+ and Mg2+) ThermoFisher Scientific 11503387
Prolong Gold Antifade Reagent ThermoFisher Scientific P36934
Triton X-100 SIGMA-ALDRICH 93443 Harmful
Sample cryofixation
Liquid nitrogen air liquids sante Harmful
Methylbutane >=99% SIGMA-ALDRICH  M32631-1L Caution toxic
Aluminium transfer plate Home-made
Distilled and deionized water Home-made Produced in the laboratory using the Barnstead Smart2Pure system
Parafilm VWR 52858-000
Equipment
Barnstead Smart2Pure ThermoFisher Scientific 50129870
Biosafety bench, class II ThermoFisher Scientific MSC-Advantage
TC20 automated cell counter Biorad 145-0102SP
Counting slides 2 wells Biorad 1450016
PIPS detector, 25 mm2, 12 keV energy resolution @5.5 MeV Canberra  PD25-12-100AM
High-resolution Si (Li) solid-state detector,145-eVenergy resolution, @Mn-Kα Oxford Instruments
Everhart-Thornley type secondary electron detector (SED)  Orsay Physics 1-SED
XRF Calibration Standard sodium or Chlorine as NaCl Micromatter 34381
XRF Calibration Standard Magnesium as MgF2 Micromatter 34382
XRF Calibration Standard Aluminium as Al metal Micromatter 34383
XRF Calibration Standard Silicon as SiO Micromatter 34384
XRF Calibration Standard Sulfur as CuSx Micromatter 34385
XRF Calibration Standard Calcium as CaF2 Micromatter 34387
XRF Calibration Standard Titanium as Ti metal Micromatter 34388
XRF Calibration Standard Iron as Fe metal Micromatter 34389
Sonicator 750W Sonics Materials 11743619
3MM microprobe Bioblock scientific 220-05
Lyophilizer in vacuum Elexience EK3147
Optical microscope Zeiss AxioObserver Z1 Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 431006-9901
Motorized stage xy Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 432031-9902
EC Plan-Neofluar 20X, NA 0.50 Ph2 M27 objective Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 420351-9910
Plan-Apochromat 63X, NA 1,40 Ph3M27 objective Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 420781-9910
Zeiss filterset 02 Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 488002-9901
Zeiss filterset 38HE Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 489038-9901
Zeiss filterset 31 Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 000000-1031-350
Chemical fume hood Erlab Captair SD321
Particle accelerator HVEE singletron
Software
ImageJ software National Institutes of health, USA ImageJ 1.51
SimNRA software Max-Planck-Institut für Plasmaphysik, Germany SIMNRA 6.06
Gupix software Guelph university, Canada GUPIXWIN 2.2.4

References

  1. Krug, H. F., Wick, P. Nanotoxicology: An Interdisciplinary Challenge. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (6), 1260-1278 (2011).
  2. Van Hove, M. A. From surface science to nanotechnology. Catalysis Today. 113 (3-4), 133-140 (2006).
  3. Le Trequesser, Q., Seznec, H., Delville, M. H. Functionalized nanomaterials: their use as contrast agents in bioimaging: mono- and multimodal approaches. Nanotox. Rev. 2 (2), 125-169 (2013).
  4. Oberdorster, G. Safety assessment for nanotechnology and nanomedicine: concepts of nanotoxicology. J. Int. Med. , 89-105 (2009).
  5. Savolainen, K., et al. Nanotechnologies, engineered nanomaterials and occupational health and safety – A review. Saf. Sci. 48 (8), 957-963 (2010).
  6. Savolainen, K., Alenius, H., Norppa, H., Pylkkanen, L., Tuomi, T., Kasper, G. Risk assessment of engineered nanomaterials and nanotechnologies – A review. Toxicol. 269 (2-3), 92-104 (2010).
  7. Arora, S., Rajwade, J. M., Paknikar, K. M. Nanotoxicology and in vitro studies: The need of the hour. Toxicol. . Appl. Pharm. 258 (2), 151-165 (2012).
  8. Donaldson, K. Resolving the nanoparticles paradox. Future Med. 1 (2), 229-234 (2006).
  9. Schaumann, G. E., et al. Understanding the fate and biological effects of Ag- and TiO2-nanoparticles in the environment: The quest for advanced analytics and interdisciplinary concepts. Sci Total Environ. 535, 3-19 (2014).
  10. Olesik, J. W. . Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometers. Treatise on Geochemistry. , (2014).
  11. Krystek, P. A review on approaches to bio-distribution studies about gold and silver engineered nanoparticles by inductively coupled plasma mass spectrometry. Microchem. J. 105 (November 2011), 39-43 (2012).
  12. Le Trequesser, Q., et al. Multimodal correlative microscopy for in situ detection and quantification of chemical elements in biological specimens. Applications to nanotoxicology. J .Chem. Biol. 8 (4), 159-167 (2015).
  13. Le Trequesser, Q., et al. Single cell in situ detection and quantification of metal oxide nanoparticles using multimodal correlative microscopy. Anal. Chem. 86 (15), 7311-7319 (2014).
  14. Ackermann, C. M., Lee, S., Chang, C. J. Analytical Methods for Imaging Metals in Biology: From Transition Metal Metabolism to Transition Metal Signaling. Anal. Chem. 89 (1), 22-41 (2017).
  15. Legin, A. A., et al. NanoSIMS combined with fluorescence microscopy as a tool for subcellular imaging of isotopically labeled platinum-based anticancer drugs. Chem. Sci. 5, 3135 (2014).
  16. Lanni, E. J., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Mass spectrometry imaging and profiling of single cells. J. Proteomics. 75 (16), 5036-5051 (2012).
  17. Waypa, G. B., et al. Hypoxia triggers subcellular compartmental redox signaling in vascular smooth muscle cells. Circ. Res. 106 (3), 526-535 (2010).
  18. Dooley, C. T., et al. Imaging Dynamic Redox Changes in Mammalian Cells with Green Fluorescent Protein Indicators. J. Biol. Chem. 279 (21), 22284-22293 (2004).
  19. Hanson, G. T., et al. Investigating Mitochondrial Redox Potential with Redox-sensitive Green Fluorescent Protein Indicators. J. Biol. Chem. 279 (13), 13044-13053 (2004).
  20. Chen, X., Mao, S. S. Titanium dioxide nanomaterials: Synthesis, properties, modifications and applications. Chem. Rev. 107 (7), 2891-2959 (2007).
  21. Simon, M., Barberet, P., Delville, M. H., Moretto, P., Seznec, H. Titanium dioxide nanoparticles induced intracellular calcium homeostasis modi fi cation in primary human keratinocytes. Towards an in vitro explanation of titanium dioxide nanoparticles toxicity. Nanotox. 5 (June), 125-139 (2011).
  22. Sorieul, S., et al. An ion beam facility for multidisciplinary research. Nucl. Instr. Meth. Phys. Res., B. 332, 68-73 (2014).
  23. Barberet, P., et al. First results obtained using the CENBG nanobeam line: Performances and applications. Nucl Instr Meth Phys Res B. 269 (20), 2163-2167 (2011).
  24. Devès, G., et al. An ImageJ plugin for ion beam imaging and data processing at AIFIRA facility. Nucl. Instr. Meth. Phys. Res. B. 348, 62-67 (2015).
  25. Mayer, M. . SIMNRA User’s Guide, Report IPP 9/113. , (1997).
  26. Campbell, J. L., Boyd, N. I., Grassi, N., Bonnick, P., Maxwell, J. A. The Guelph PIXE software package IV. Nucl. Instr. Meth. Phys. Res. B. 268 (20), 3356-3363 (2010).
  27. Yu, K., Chang, S., Park, S. J., Lim, J., Lee, J. Titanium Dioxide Nanoparticles Induce Endoplasmic Reticulum Stress-Mediated Autophagic Cell Death via Mitochondria- Associated Endoplasmic Reticulum Membrane Disruption in Normal Lung Cells. PLoS ONE. , 1-17 (2015).

Play Video

Cite This Article
Muggiolu, G., Simon, M., Lampe, N., Devès, G., Barberet, P., Michelet, C., Delville, M., Seznec, H. In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis. J. Vis. Exp. (132), e55041, doi:10.3791/55041 (2018).

View Video