Summary

La manipulación de epileptiforme Electrocorticograms (ECoGs) y del sueño en ratas y ratones por acupuntura

Published: December 22, 2016
doi:

Summary

This paper demonstrates the performance of acupuncture, epilepsy models, and the analysis of sleep in rodents. The acupuncture procedure and the identification of acupoints are described. Pilocarpine or pentylenetetrazol (PTZ) is used to induce epilepsy. Electrocorticogram (ECoG), electromyogram (EMG), brain temperature, and locomotor activity recordings are employed for sleep analysis.

Abstract

Ancient Chinese literature has documented that acupuncture possesses efficient therapeutic effects on epilepsy and insomnia. There is, however, little research to reveal the possible mechanisms behind these effects. To investigate the effect of acupuncture on epilepsy and sleep, several issues need to be addressed. The first is to identify the acupoints, which correspond between humans, rats, and mice. Furthermore, the depth of insertion of the acupuncture needle, the degree of needle twist in manual needle acupuncture, and the stimulation parameters for electroacupuncture (EA) need to be determined. To evaluate the effects of acupuncture on epilepsy and sleep, a feasible model of epilepsy in rodents is required. We administer pilocarpine into the left central nucleus of the amygdala (CeA) to simulate focal temporal lobe epilepsy (TLE) in rats. Intraperitoneal (IP) injection of pilocarpine induces generalized epilepsy and status epilepticus (SE) in rats. Five IP injections of pentylenetetrazol (PTZ) with a one-day interval between each injection successfully induces spontaneous generalized epilepsy in mice. Recordings of electrocorticograms (ECoGs), electromyograms (EMGs), brain temperature, and locomotor activity are used for sleep analysis in rats, while ECoGs, EMGs, and locomotor activity are employed for sleep analysis in mice. ECoG electrodes are implanted into the frontal, parietal, and contralateral occipital cortices, and a thermistor is implanted above the cerebral cortex by stereotactic surgery. EMG electrodes are implanted into the neck muscles, and an infrared detector determines locomotor activity. The criteria for categorizing vigilance stages, including wakefulness, rapid eye movement (REM) sleep, and non-REM (NREM) sleep are based on information from ECoGs, EMGs, brain temperature, and locomotor activity. Detailed classification criteria are stated in the text.

Introduction

La epilepsia es un trastorno neurológico común en el que se producen convulsiones recurrentes durante toda la vida de un paciente. La mayoría de las recurrencias epilépticos pueden ser bien controlados por los fármacos antiepilépticos (FAE). Sin embargo, aproximadamente 30% de los pacientes epilépticos desarrollar epilepsia refractaria 1. causas de la epilepsia, trastornos del sueño, que pueden exacerbar aún más la recurrencia. La evidencia demuestra que la epilepsia puede perturbar el sueño, ya sea por la noche o puede causar excesiva somnolencia durante el día 2,3. Nuestros estudios previos indican además que la epilepsia se produce en el momento zeitgeber (ZT) 0, es decir, el inicio del período de luz a la luz: oscuridad ciclo, disminuye el sueño; este es mediada por la hormona liberadora de corticotropina (CRH), un factor homeostático. Epilepsia en ZT13 (el comienzo del periodo de oscuridad) aumenta la expresión de otro factor homeostático, la interleucina-1 (IL-1), lo que aumenta el sueño. Sueño ritmos circadianos se alteran cuando la epilepsia se produce en ZT6, el medio de laperíodo de luz 4,5. Por otra parte, los problemas de sueño exacerbar aún más la progresión y recurrencia de la epilepsia 6. Sobre la base de la evidencia mencionada, tratamos de revelar un método terapéutico óptimo para controlar simultáneamente la epilepsia y prevenir las alteraciones del sueño en pacientes con epilepsia. Hemos encontrado previamente que la electroacupuntura (EA) con una frecuencia de estimulación de 10 Hz, en el que se suministra una cierta cantidad de corriente en el punto de acupuntura través de una aguja de acero inoxidable, suprime con éxito electrocorticograma (ECoG) actividades de epilepsia y trastornos del sueño epilepsia inducida 7 . EA con una frecuencia de estimulación de 100 Hz se deteriora aún más las actividades de epilepsia y trastornos del sueño en ratas 8,9. Este experimento exitoso depende de tres factores: en primer lugar, un modelo animal de epilepsia factible; en segundo lugar, un método para la grabación de sueño y el análisis en roedores; y en tercer lugar, el funcionamiento exacto de la acupuntura y la precisión del punto de acupuntura Locations.

La epilepsia se ha clasificado en dos tipos principales: la epilepsia focal y epilepsia generalizada. Estamos interesados ​​en la epilepsia focal del lóbulo temporal (TLE), la epilepsia generalizada, estado epiléptico (SE), y la recurrencia de la epilepsia generalizada espontánea. Por lo tanto, diferentes manipulaciones se aplican para crear modelos de epilepsia adecuados para nuestros experimentos. Para establecer TLE focal, una dosis baja de pilocarpina se administra en el núcleo central de la amígdala izquierda (CEA). Para verificar este modelo, seis electrodos ECoG se implantan en el frontal (F1 y F2), parietal (P1 y P2), y occipital (O1 y O2) lóbulos en ambos hemisferios izquierdo y derecho, y otros dos electrodos de referencia (R1 y R2) se coloca sobre el cerebelo en ambos hemisferios. Una guía microinyección cánula adicional se implanta quirúrgicamente en el izquierdo CEA (AP, 2,8 mm de bregma; ml, 4,2 mm; DV, 7,8 mm con respecto al bregma). Las coordenadas son una adaptación de la Paxinos y Watlas rata atson 10. Si el TLE focal se induce con éxito, sólo la grabación desde el electrodo sobre la corteza parietal izquierda (P1), que está cerca del CEA izquierda, debería adquirir las ECoGs epileptiformes dominantes, sin ECoGs epileptiformes significativos registrados a partir de los otros electrodos ECoG. Intraperitoneal (ip) del pilocarpina en ratas inducen epilepsia generalizada y SE, pero esto puede ser fatal. Cinco inyecciones IP de pentilentetrazol (PTZ) con un intervalo de un día entre cada inyección inducen con éxito la epilepsia generalizada espontánea en ratones y también asegurar la supervivencia de los ratones. Dos electrodos ECoG alambre se implantan en la corteza frontal y parietal en los ratones para recibir señales de ECoG y para verificar la epilepsia de manera espontánea recurrente.

La polisomnografía (PSG) es un método integral para registrar los cambios fisiológicos que se producen durante el sueño, y se puede clasificar de manera objetiva el sueño en diferentes etapas del movimiento no rápido de los ojos (NREM) yrAPID movimiento de los ojos (REM) del sueño. PSG registra los parámetros de las funciones del cuerpo, incluyendo las ondas cerebrales (electroencefalograma, EEG), los movimientos oculares (electrooculogram, EOG), tonos de músculo esquelético (electromiograma, EMG), ritmos cardíacos (electrocardiograma, ECG), y los niveles de oxígeno en la sangre y los parámetros respiratorios. En ratas, registramos ECoGs, EMG, la temperatura cortical y la actividad locomotora de clasificar los estados de vigilancia en la vigilia, el sueño NREM y el sueño REM. El análisis del sueño en ratones se llevó a cabo utilizando ECoGs, EMG, y los resultados de la actividad locomotora. Las ratas se implantan quirúrgicamente con tres ECoG tornillo de electrodos en el frontal, parietal, y la corteza cerebelosa contralateral por cirugía estereotáxica. determinación posterior a la adquisición de los estados de vigilancia (vigilia, sueño NREM y sueño REM) se lleva a cabo de acuerdo con los parámetros obtenidos de los ECoGs, EMG, la temperatura del cerebro, y la actividad locomotora. criterios detallados para categorizar el comportamiento del animal en ratas y ratones se describen en tél protocolo.

Ambas ratas y ratones necesitan ser anestesiados con una dosis baja de Zoletil (25 mg / kg), que es la mitad de la dosis de los anestésicos normalmente administrados durante la cirugía estereotáxica, antes de realizar la acupuntura manual o EA. Esta dosis permite que los animales se despiertan de 30 a 35 minutos después de la inyección. Cualquiera de acupuntura manual o EA se lleva a cabo al comienzo del período de oscuridad, con un período constante de tiempo de 30 min, y cada animal se trata consecutivamente durante dos a tres días. Estimular las corrientes de EA son entregados en un punto de acupuntura particular a través de una aguja de acero inoxidable que se inserta en el punto de acupuntura. La corriente de estímulo es un tren de pulsos cuadrados bifásicos, en el que la duración del pulso es de 150 ms y la intensidad de estimulación es 1 mA. Si se utiliza una aguja seca para la acupuntura manual, la aguja insertada en los puntos de acupuntura se retorció 10 veces cada 5 min. La parte difícil de la acupuntura manual o EA es localizar los puntos de acupuntura en los roedores. el locación de los puntos de acupuntura en ratas o ratones es similar a su localización anatómica en los seres humanos. Por ejemplo, los puntos de acupuntura bilaterales Fengchi se encuentran 3 mm de distancia de la línea media posterior sobre el cuello, entre las dos orejas, que es similar a su localización anatómica en humanos 11. Por otra parte, los puntos de acupuntura con baja impedancia en la piel se pueden confirmar aún más. acupuntura o EA farsa manipulación simulada es necesario que la acupuntura o experimentos de EA. La acupuntura simulada o EA farsa deben llevarse a cabo en un punto de acupuntura no se encuentra cerca del punto de acupuntura, por ejemplo, cerca de la axila 12.

Para investigar con éxito los efectos de la acupuntura o la EA sobre la epilepsia y los trastornos del sueño epilepsia inducida, los siguientes factores deben estar en su lugar: un posible modelo de epilepsia animal, el análisis preciso de ECoGs epileptiformes y la recurrencia de la epilepsia, un método para clasificar los estados de vigilancia y el funcionamiento exacto de la acupuntura o la EA en los roedores.

Protocol

Todos los protocolos experimentales son aprobados por el Comité Institucional de Cuidado de Animales y el empleo (IACUC) de la Universidad Nacional de Taiwán. 1. Cirugía estereotáxica para la implantación de electrodos ECoG, EMG electrodos, Brain termistor, y la Guía de inyección cánula Para las ratas (250-350 g, de 6 a 8 semanas de edad, las ratas Sprague-Dawley) Anestesiar las ratas por inyección ip con 50 mg / kg Zoletil. Confirmar la profundi…

Representative Results

Existen diferentes modelos de rata y ratón para satisfacer las necesidades de los diferentes tipos de epilepsia. Para inducir la TLE focal, 0,5 l de pilocarpina se administra (2,4 mg / l) en el CEA izquierda. Los ECoGs epileptiformes predominantes se adquieren desde el electrodo de ECoG en el lóbulo parietal del hemisferio izquierdo (Figura 1A: b) se recogen, y las actividades epilépticos raras desde el resto de los electrodos ECoG (Figura 1A: <strong…

Discussion

La elección de un modelo animal de epilepsia viable es esencial para cada propósito experimental. Uno de nuestros objetivos es dilucidar los efectos de la EA en la supresión de la epilepsia. EA es una medicina alternativa que puede exhibir efecto terapéutico en la epilepsia y ha sido documentado en la literatura china antigua. Sin embargo, hay una falta de evidencia científica para demostrarlo. Para determinar los efectos de la EA en la epilepsia, nos hemos centrado principalmente en los efectos de la EA en la epil…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by Ministry of Science and Technology (MOST) grants MOST104-2410-H-002-053 & NSC99-2320-B-002-026-MY3. This manuscript was edited and proofread by Mr. Brian Chang, who has experience revising professional documents.

Materials

Drugs
Zoletil Virbac 50 mg/kg i.p.
pilocarpine Sigma-Aldrich P6503 300 mg/kg i.p.; 1.2 mg microinjection
PTZ Sigma-Aldrich P6500 0.035 mg/mouse
polysporin Pfizer
Surgery
ECoG electrode Plastics One E363/20 screw electrode for rats
Pedestal Plastics One MS363
Cannula Plastics One C315G/spc
Thermistor Omega Engineering 44008
Dental acrylic Tempron
Stereotaxic Instrument Stoelting Dural arms
Recording equipments
ECoG amplifier Colbourn Instruments V75-01
A/D Board National Instruments NI PCI-6033E
Infrared-based motion detectors Biobserve GmbH custom-made
ICELUS G-System
AxoScope 10 Software Molecular Devices
Acupuncture needs
Stainless needles Shanghai Yanglong Medical Articles Co. 32 gauge x 1”
Functions Electrical Stimulator I.T.O., Japan Trio 300
AcuPen Lhasa OMS Pointer Excel II

References

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Cite This Article
Yi, P., Jou, S., Wu, Y., Chang, F. Manipulation of Epileptiform Electrocorticograms (ECoGs) and Sleep in Rats and Mice by Acupuncture. J. Vis. Exp. (118), e54896, doi:10.3791/54896 (2016).

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