在线体积排阻和离子交换色谱法SAXS光束线

1.离线准备的说明和样本生成一个D5缺失的蛋白质注：D5 323-785构建体（ 图1A）中的克隆，表达，和纯化如所述18。 克隆构建成pProEx HTb中矢量 执行使用5'-GCGCCATGGGTAATAAACTGTTTAATATTGCAC-3'和5'-ATGCAAGCTTTTACGGAGATGAAATATCCTCTATGA-3'引物和聚合酶的PCR反应混合物，按照制造商的建议上D5R聚合酶链式反应（PCR）。 通过离心柱纯化PCR片段，按照制造商的建议。 消化的PCR片段并与NcoI和HindIII限制性内切酶的质粒，按照制造商的缓冲组合物和培养时间的建议。 运行在0.5×TAE缓冲液在1％琼脂糖凝胶（所述片段的20mM Tris，10mM的醋酸，和0.5mM EDTA）并弄脏用DNA染料的凝胶。 揭露凝胶紫外光。 注意：请佩戴个人安全装备！切出的消化的PCR片段的带和消化的质粒和使用凝胶纯化旋转柱试剂盒纯化该DNA，按照制造商的建议。 使用快速连接试剂盒，按照制造商的建议，结扎纯化的PCR片段插入质粒。 通过热休克从连接反应转化为质粒扩增优化主管细菌转化的产物。 一半连接产物添加到细菌的小瓶。 在冰上孵育反应管20分钟。 孵育在42℃的管30秒。 放置在冰上的管2分钟。 添加的Luria BERTANI毫升（LB）肉汤（米勒）不含抗生素1，并让细胞在37℃恢复1小时。 降速细胞在16100 XG FO的R 3在台式离心机微管，并除去大部分的介质。 传播细胞到具有氨苄青霉素（50微克/毫升终浓度）的LB琼脂平板，并让菌落在37℃生长过夜。 将一个菌落分为3毫升的LB氨苄青霉素（50微克/毫升最终）和壮大文化在37℃，在160 rpm振摇过夜。 按照小量制备试剂盒提取质粒的指令。 发送质粒进行测序的样品，并分析了没有突变和为正确的插入序列。 变换pProEx HTb中D5 323-785构建成表达优化菌（使用1μL，并按照步骤1.1.7步骤）。传播细菌到具有氨苄青霉素（50微克/毫升终浓度）的LB琼脂板上。 要创建开始培养，把一个菌落在300ml的LB氨苄青霉素（50微克/毫升终浓度）并在37℃下生长的细菌，在160ř摇动下午过夜。 接种12×1升的LB氨苄青霉素的存在下（50微克/毫升终浓度），每20毫升的pProEx HTb中D5 323-785细菌起子培养的，在37℃，直到OD 600 = 0.3为止。降低温度至18℃，并在的OD 600 = 0.5，用1mM IPTG诱导表达。孵育文化，在160转，18℃过夜摇晃他们。 收获离心细菌以50,000 xg离心并在4℃下进行30分钟。重悬细菌粒料在约150毫升的裂解缓冲液（50毫摩尔Tris-盐酸[pH为7]，150 mM氯化钠，5mM的MgCl 2的，10毫β巯基乙醇，和10％甘油）用1×蛋白酶抑制剂和25个单位（ U）/ 10毫升的DNA酶。通过裂解超声冰上细菌（1英寸探头，50％的功率，0.5的脉搏，0.5秒暂停，3个5分钟）。 加载上清液到镍亲和柱（Ni柱，1.5毫升床体积），以及用b的10个柱体积（CV）的洗inding缓冲液（50mM的Tris-HCl [pH为7]，150毫摩尔NaCl，10毫β巯基乙醇，和10％甘油），洗涤液10的CV（50毫摩尔Tris-盐酸[pH为7]，1 M氯化钠，10毫β巯基乙醇，和10％甘油），和咪唑洗10 CV（50毫摩尔Tris-盐酸[pH为7]，150毫摩尔NaCl，10毫β巯基乙醇，10％甘油，和30 mM咪唑）。洗脱D5 323-785（20毫Tris-盐酸[pH为7]，150毫摩尔NaCl，10毫β巯基乙醇，10％甘油，和200mM的咪唑）。 检查通过十二烷基硫酸钠（SDS） – 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）在不同纯化步骤。 负载2-20μL的各纯化步骤的流通用1×上样染料混合（2次：4％SDS，20％甘油，120毫摩尔Tris-盐酸[pH为6.8]，和0.02％重量/体积的溴酚蓝）上的10 ％SDS凝胶和在1倍的Laemmli 200伏运行它们运行缓冲液（25mM的Tris，0.192甘氨酸和0.1％SDS）中。 染色用现成的使用考马斯蓝溶液的凝胶。 EXC焊割使用根据制造商的手册脱盐柱结合缓冲液洗脱的蛋白的缓冲器。 通过加入烟草蚀纹病毒核包涵体一个内肽酶 （TEV，1毫克/ 100毫克蛋白）的蛋白质溶液裂解His-标签。在室温下孵育过夜。 通过执行SDS-PAGE检查消化（见步骤1.5） 平衡在结合缓冲液中Ni柱。让蛋白质溶液通过用2的CV咪唑洗涤缓冲液洗珠而流过收集。 用离心浓缩至0.5毫升的最终体积浓缩蛋白质。 注入浓缩的蛋白质上与凝胶过滤缓冲液平衡的大小排阻柱（20毫Tris-盐酸[pH为7]，150毫摩尔NaCl，10％甘油和1mM二硫苏糖醇[DTT]）。 通过流入0.5毫升馏分收集。 检查峰样品通过在蛋白质的存在和纯度进行SDS-PAGE（见步骤1.5）。 结合D5 323-785的洗脱峰的级分。稀释样品至25毫摩尔NaCl和5％的甘油，同时保持Tris和DTT浓度恒定（5毫升蛋白质溶液在20mM的Tris-HCl [pH为7]，150毫摩尔NaCl，10％甘油，和1mM DTT，首先添加5毫升的20mM的Tris-HCl [pH为7]和1mM DTT的，然后添加20毫摩尔Tris-盐酸[pH为7]，5％甘油，和1mM DTT）的20毫升。 加载样品上的离子交换柱。使用缓冲液A（20毫摩尔Tris [pH为7，25 mM氯化钠，5％甘油，和1mM DTT）和缓冲液B（20毫摩尔Tris [pH为7]，1 M氯化钠，5％甘油，和1mM DTT）以形成的盐梯度从25mM至1M。 收集洗脱的蛋白在1.5毫升的级分。 通过进行SDS-PAGE检查峰样品中蛋白质的存在和纯度（参见步骤1.5和图1B） Reconcentrate在离心浓缩至0.5毫升的最终体积的蛋白质溶液。 ReruN于在凝胶过滤缓冲液中的大小排阻柱浓缩的蛋白质（的20mM Tris – 盐酸[pH为7]，150 mM氯化钠，5％甘油，和1mM DTT;见步骤1.11）。 2，数据收集注：尽早申请束的时间。对于ESRF，可用的接入类型以及如何提交申请指南可以在这里找到： http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying 。接受该建议，并为实验的邀请后，所有参与者都完成安全培训。培训的有效性后，填写“A型”（通过用户ESRF门户）宣布，研究人员访问了实验束线，对样品所需的安全信息。联系当地联络人讨论实验。 SEC-SAXS数据收集 注：对于ONLINE纯化，使用高效液相色谱（HPLC）安装在BM29系统。该系统包括一个在线脱气，二元泵，用于缓冲器选择和梯度，自动取样器，一个UV-VIS阵列photospectrometer，和一个电导阀的。它被直接连接到SAXS曝光单元19的流过毛细管。 把1毫升的凝胶过滤缓冲的一边。连接缓冲液瓶向SEC系统（默认端口号为A）。 选择取决于所使用的柱的流速。注意：对于这里使用的尺寸排阻柱，流速为0.1毫升/分钟。定义列的最大压力，注意回压，以及采集时间设置为至少1.2 CV。 通过“自动清理”功能，冲洗泵和上游管。 等到系统充满了缓冲和连接柱。通过使至少1.5 CV平衡色谱柱。 连锁双雄和测量缓冲步骤2.1.1作废，使用自动进样器的信号变化，以控制由于辐射伤害。仅当有到缓冲无辐射损伤继续。 束线控制系统切换到HPLC模式。做缓冲的试运行，采集200帧，每帧1秒。写在求和强度情节由检测给定的计数数目。 注意：信号应与先前测量的缓冲器，并随着时间的推移的求和强度应保持不变。如果信号不匹配或不恒定，需要系统的较长的平衡。 降速样品以13,000rpm XG在台式微型管离心至少10分钟。 填写样品到HPLC兼容的玻璃小瓶（提供），放入自动注射器。注意不错。 互锁使用标准程序实验双雄，如用户安全培训解释。 登录到并通过束线控制软件创建的数据存储的文件夹。 程序中使用了“快批”功能的高效液相色谱系统。设置的存储位置的UV数据在步骤2.1.10创建文件夹。确保激活UV数据的自动ASCII转换，存储ASCII文件在同一文件夹。 选择注射量和井位。添加测量通过按下“开始”按钮来排队。该软件会要求保存批处理。准备储蓄，但不要按“保存”按钮，这将自动启动测量。 设立在光束线控制软件数据收集参数。选择的帧的数量，以使总的数据采集时间是在稍过量的在步骤2.1.2中定义的采集时间。 打开安全快门，并使用束线控制软件开始SAXS数据收集。验证数据是心病rectly收购。新收集的数据进行比较，以在步骤2.1.6收集到的数据，并检查了至少100帧在总结强度计数的数量保持不变，值从步骤2.1.6匹配。 启动SEC按“保存”按钮运行，如步骤2.1.11准备，并注意在注射完成和UV数据采集开始在camserver软件中显示的帧数。 数据收集后，打开ISPyB数据库20在打开“数据采集”选项卡，点击“开始”按钮，进入数据集和自动分析21的结果。 IEC-SAXS数据收集 注：代替在IEC实验通常所施加的连续的线性梯度，使用逐步梯度，其中缓冲液B的量在预先设定的离散的步骤增加。 为SAMPL创建HPLC程序电子无缓冲运行。编程分步梯度从0％缓冲液B开始并达到的缓冲液B 100％，直到经过两CV由5个百分点。 把一些每个缓冲区的一边。瓶子将随低盐缓冲液A端口A和一个具有高盐缓冲液B端口B. 选择的流速和保持低于塔的压力极限（在这个例子中，1毫升/分钟）。 如在步骤2.1.3，通过使用“自动清洁”功能冲洗泵和上游管。 平衡在低盐缓冲液A的系统（见步骤1.15），并连接所述离子交换柱。等到柱子完全平衡（至少1.5 CV）。 使用缓冲区预留步骤2.2.2检查缓冲区A和B使用样品转换，如步骤2.1.5辐射伤害。 检查缓冲器出来的列的，如在步骤2.1.6。比较信号记录在步骤2.2.6缓冲区中的信号。注意再次在求和强度情节计数数目。 创建的数据存储在缓冲器运行的文件夹。 建立数据收集在HPLC系统模式。选择的帧的数量，以使总的数据采集时间是在过量的IEC运行的总时间（参见步骤2.2.1）。 打开安全快门，并启动SAXS数据收集。验证它是否正确地进行并仔细检查了总结强度保持在步骤2.2.7指出，至少100帧数值不变。 使用HPLC软件的“单次运行”的功能，并开始在步骤2.2.1编程的分步梯度。为注射剂，为了在这个步骤中注入没有样品设置瓶号为-1。写下在程序启动时获得的帧数。 创建示例运行的HPLC程序。编程分步梯度从缓冲液B估计的0％缓冲液B中的每个峰在步骤1.1.5脱机测量的百分比开始（ <str翁>图1B）。置正好1个点以下和感兴趣的峰高于1.5分的至少3个步骤，每2.5 CV（ 图1C）。加在100％缓冲液B的最终步骤为2.5的简历。 降速样品以13,000rpm XG在台式微型管离心至少10分钟。 通过用20mM的Tris-HCl [pH为7]，10％甘油，和1mM DTT混合，稀释D5 323-785成缓冲液A（25毫米）的盐浓度。 手动加载样品到柱上。把缓冲区中的输入管插入稀释的样品暂停泵避免气泡产生后形成的。断开检测器的列直接收集从柱中流通。 当样本容器几乎是空的，则返回该输入管成缓冲液A（再次暂停泵而移动所述管），并重新启动用缓冲液A泵送至样品从管转移到柱上。一旦整个样本已经加载，通过2 CV缓冲液A，然后重新连接列探测器。 对于样品运行，创建用于数据存储的文件夹。 打开安全快门，并启动SAXS数据收集。验证数据收集正确进行并仔细检查了总结强度保持在步骤2.2.7指出，至少100帧数值不变。 用HPLC软件的“单次运行”功能启动步骤2.2.12编程的逐步梯度。为注射剂，为了在这个步骤中注入没有样品设置瓶号为-1。写下在程序启动时获得的帧数。 在ISPyB 20打开“数据采集”，按“走出去”看数据集和自动分析21。 通过“后运行分析”软件出口从HPLC系统，以ASCII格式的UV数据。 3。SEC-SAXS数据缩减和分析按“转到”按钮打开ISPyB数据采集的数据。确定在该帧的SAXS数据集合的概述对应洗脱峰。验证回转半径在整个峰稳定。 确认自动缓冲区修正正确执行。从峰值的中心部分成与实验SAXS数据执行操作文件22和平均他们一个程序装入帧。然后，装入自动生成缓冲文件，并检查是否平均帧的高Q值区和缓冲区帧匹配。 整个比较定量使用CORMAP测试23峰采集的帧。 加载覆盖的感兴趣的区域的帧的自动创建减法（* _sub.dat文件）。 按“比例”按钮将其扩展到对方。 COMPARË他们使用“数据比较”功能。应在整个峰的帧之间没有系统的变化。 打开所有感兴趣的* -_ sub.dat帧，使用“合并”按钮将它们合并，并保存.dat文件合并文件。 确定与在程序中“回转半径”工具的回转半径，并指出在吉尼耶范围中的第一个数据点在低分辨率数据的后面裁剪。 确定与在节目中的“距离分布”工具对距离分布函数和保存生成的.out文件为gnom.out。 4. 从头建模在Unix机器上，运行无对称性限制40× 从头模型重建计划。创建一个新的文件夹和gnom.out文件复制到它。运行程序如下： 为（（i = 1; I <= 40;我++））;做dammif gnom.out -ms -p dammifp1_ $ I; ð一类似地，与运行在第二个文件夹六倍对称性对称性限制的从头模型重建方案： 为（（i = 1; I <= 40;我++））;做dammif gnom.out -ms -s P6 -p dammifp6_ $ I; DONE 对齐所有从头模型重建程序输出文件（* -1.pdb）。在从步骤4.1和4.2两个文件夹，运行damaver -a * -1.pdb。 打开所有车型（damaver.pdb），以及在合适的分子可视化软件26过滤，以正确的体积（damfilt.pdb）模型的工会并进行比较。 打开一个文本编辑器中damsel.log文件。列为“参考”的文件的底部的模型是最有代表性的模式。 5. IEC-SAXS数据缩减，分析和建模在该实验的SAXS数据文件22进行操作的程序，加载约50 SAXS从各混合步骤帧缓冲运行，按“平均”按钮，保存结果。 基于经由ISPyB可用的自动处理结果，确定实验的哪些帧对应于蛋白质的洗脱，并验证回转（初步）半径在整个峰稳定。 加载帧入实验SAXS数据文件处理程序22和平均它们，作为缓冲帧（见步骤5.1）来完成。然后，装载在步骤5.1中产生的缓冲文件并比较（以上4.2纳米-1）高Q的区域，发现从峰，平均匹配的缓冲器。 注：不应该有系统从峰值和缓冲的平均之间的偏移。如果样品曲线似乎两个缓冲曲线之间下降，通过计算平均插值它们的曲线。 减去确定为从峰值部分的平均散射曲线的最佳匹配缓冲区，并保存生成的subtr行动文件。另外，使用来自前面和后面的混合步骤的平均缓冲器曲线来估计减法的误差消减曲线。 为峰的左和右两半重复步骤5.3和5.4分别并比较的结果，那些来自步骤5.4以检查整个峰的信号的稳定性。 按照步骤，从步骤5.4所有三个曲线减去3.5和3.6。 比较所有三个减去曲线的结果。 注意：只有减法的误差范围内保持强劲结果是可信的。 在步骤在步骤5.3确定最佳的减4.1和4.2进行建模。 按照步骤4.3到4.5对齐模式，并确定最有代表性之一。 6.结果比较运行一个程序叠加的三维结构在美国证券交易委员会的代表机型12（步骤4.5）的ðIEC-SAXS数据（步骤5.9）与P6对称性：supcomb model_sec.pdb model_iec.pdb 导入model_sec.pdb和model_iec-r.pdb成分子可视化软件。 打开modelsec.pdb的.fir文件，并在电子表格中modeliec-r.pdb，创造实验和计算的散射曲线的2D图形。