자외선 VI와 라만 분광학 면역 플랫폼 제조
Summary
Nanoparticle-based optical probes have been designed as a vehicle for detecting antigens using Raman and UV-Vis spectroscopy. Here we describe a protocol for preparing such probes for a UV-Vis/Raman spectroscopy immunoassay in such a way to incorporate future multiplexing capabilities.
Abstract
면역은 관련된 항체의 존재 여부에 따라 단백질을 검출하기 위해 사용된다. 때문에 연구와 임상에서의 광범위한 사용으로, 면역 기기 및 재료의 대형 인프라 찾을 수 있습니다. 예를 들어, 96 및 384 웰 폴리스티렌 플레이트를 상업적으로 사용할 수있는 다양한 제조업체의 자외선 – 가시 광선 (UV-비스) 분광 시스템을 수용하기 위해 표준 디자인을 가지고있다. 또, 효소 면역 분석법 (ELISA)과 같은 면역 맞춤 설계를위한 면역 글로불린을 검출 태그 및 차단제 다양한 가능하다.
기존 인프라에도 불구하고, 표준 ELISA 키트는 비용과 시간이 소모 될 수 개별적인 면역 개발을 요구하는 모든 연구의 요구를 충족하지 않는다. 그들은 일반적으로 형광 또는 COL에 의존하는 예를 들면, ELISA 키트 (한 번에 하나 이상의 분석 물을 검출) 기능이 낮은 다중화검출 orimetric 방법. 색도계 및 형광 기반의 분석은 광범위한 스펙트럼 피크에 의한 다중화 기능을 제한하고있다. 반면, 라만 분광법 기반의 방법 때문에 좁은 방출 피크에 다중화 훨씬 더 큰 능력을 가지고있다. 라만 분광기의 또 다른 장점은 라만 리포터 형광 태그 (1)에 비해 훨씬 적은 광표백을 경험한다는 것이다. 라만 기자는 형광과 색채 태그를 통해 가지고 있다는 장점에도 불구하고, 프로토콜은 라만 기반 면역이 제한된 제작합니다. 본 연구의 목적은 UV-비스 분석, 라만 분광법으로 분석 물을 직접 검출을위한 폴리스티렌 플레이트와 함께 사용하는 기능화 프로브를 제조하는 프로토콜을 제공하는 것이다. 이 프로토콜은 미리 설정된 인프라를 활용하면서 연구자가 미래 다 분석 검출 할 – 그것 – 자신의 접근 방식을 취할 수 있습니다.
Introduction
일반적인 샌드위치 면역 간접적 두 항체를 사용하여 항원의 존재를 검출한다. 포획 항체는 고체 표면에 결합 된 적절한 항원에 근접하여 항체 – 항원 복합체를 형성 할 때이다. 검출 항체는 도입 항원에 결합한다. 도 1a에 설명 된대로 세척 한 후, 항체 / 항원 / 항체 착물은 유지 및 표지 검출 항체에 의해 검출된다. 일반적인 검출 폭 넓은 스펙트럼 피크 2,3로 인해 10 분석에 다중화을 제한, 형광 또는 비색 검출기에 의해 수행된다. 반면에, 라만 기반 시스템은 최대 100 2,3- 분석 동시 검출을 주장 소스 향상 다중화 기능의 결과로 더 좁은 발광 피크를 가지고있다.
많은 문학 소스는 면역과 관련된 중요한 측면을 커버 할 수 있습니다 4-6 등 단계별로자세한 내용은 개인 ELISA 키트를 만들 수 있습니다. 불행하게도,이 프로토콜은 사용자 면역의 다중화 기능을 제한, 형광 또는 비색 검출을위한 것입니다. 이러한 필요를 해결하기 위해, 우리는도 1b에 도시 된 바와 같이 직접 면역을 위해 이전에 7 일 공개 된 UV-비스 / 라만 면역을 제조하는 구체적인 방법을 제시한다.
이 프로토콜은 기능화 된 금 나노 입자 기반 프로브의 제조,도 2에 도시를 포함한다. 금 나노 입자의 표면 (AuNPs)에 라만 기자 결합에 의해 시작 라만 / UV-마주 프로브를 확인하는 절차를. AuNPs 후, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)와 관련된 항체로 관능 화된다. AuNPs에 남은 결합 부위는 분석시 이후의 비 특이 적 결합 방지하기 위해 AuNPs에 메 톡시 폴리에틸렌 글리콜 티올 (MPEG-SH)를 결합에 의해 차단됩니다. 준비된 AuNP 프로브는 항원에 결합함으로써 테스트도 1b에 도시 된 바와 같이 폴리스티렌 플레이트의 웰에 고정시켰다. 관련 라만 기자는 라만 분광법 검출하는 동안 접시를 세척시, AuNP 프로브는 UV-마주 분광법을 사용하여 검출된다. UV-VI와 라만 스펙트럼 데이터를 결합하여이 면역의 기능을 향상 분석하는 두 가지 방법을 제공한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
자세한 프로토콜에서 해결하기 위해 몇 가지 중요한 포인트가 있습니다. 한 가지 문제는 라만 기자와 금 나노 입자의 선택입니다. 프로토콜은 개인 사용에 적합하도록 작성되었지만, 라만 리포터 DTTC 예로서 사용 하였다. DTTC는 양전하 기자 부정적인 같은 시트 레이트 출장 AuNPs로 표면을 충전하기 위해 결합한다. 이 프로토콜은 양의 표면 전하와 금 나노 입자를 사용하여 음으로 하전 기자 적응 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a Research Catalyst Award from Utah State University. The authors would like to thank Annelise Dykes, Cameron Zabriskie, and Donald Wooley for their contributions.
Materials
| 60nm Gold Nanoparticle | Ted Pella, Inc. | 15708-6 | These are citrate capped gold nanoparticles. Please see Discussion for relationship between Raman reporter and AuNP surface charge and its imporance to proper selection of AuNP and/or Raman reporter. |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Methanol | Pharmco-Aaper | 339000000 | |
| Tris Buffered Saline (10X) pH 7.5 | Scy Tek | TBD999 | |
| Bottle Top Filtration Unit | VWR | 97066-202 | |
| Tween 20 (polysorbate 20) | Scy Tek | TWN500 | Used as an emulsifying agent for washing steps. |
| Phosphate Buffered Saline 10X Concentrate, pH 7.4 | Scy Tek | PBD999 | |
| Protein LoBind Tube 2.0 mL | Eppendorf Tubes | 22431102 | LoBind tubes prevent binding of proteins and AuNPs to surfaces of the tubes. |
| Protein LoBind Tube 0.5 mL | Eppendorf Tubes | 22431064 | LoBind tubes prevent binding of proteins and AuNPs to surfaces of the tubes. |
| Microplate Devices UniSeal | GE Healthcare | 7704-0001 | Used for sealing and storing functionalized plates. |
| Assay Plate, With Low Evaporation Lid, 96 Well Flat Bottom | Costar | 3370 | |
| HPLC grade water | Sigma Aldrich | 270733-4L | |
| 3,3′-Diethylthiatricarbocyanine iodide (DTTC) | Sigma Aldrich | 381306-250MG | Raman reporter |
| mPEG-Thiol, MW 5,000 – 1 gram | Laysan Bio, Inc. | MPEG-SH-5000-1g | |
| OPSS-PEG-SVA, MW 5,000 – 1 gram | Laysan Bio, Inc. | OPSS-PEG-SVA-5000-1g | OPSS-PEG-SVA has an NHS end. |
| Mouse IgG, Whole Molecule Control | Thermo Fisher Scientific | 31903 | Antigen |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross Adsorbed Secondary Antibody | Thermo Fisher Scientific | 31164 | Antibody |
| Human Serum Albumin Blocking Solution | Sigma Aldrich | A1887-1G | Bovine serum albumin can be used instead. |
| In-house built 785nm inverted Raman microscope unit | N/A | N/A | An inverted Raman microscope is best for proper focusing onto surface of the well plate. Otherwise a very low magnification will be used due to height of the 96-well plate. An in-house built system was used as it was cheaper than buying from a vendor. However, any commercially available inverted Raman microscope system can be used. |
| Mini Centrifuge | Fisher Schientific | 12-006-900 | |
| UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 2000c | |
| UV-Vis Spectrophotometer | BioTek | Synergy 2 | |
| Desalting Columns | Thermor Scientific | 87766 |
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