Zika Virus Infectious cellodlingssystem och<em> In Vitro</em> Profylaktiska effekten av interferoner
Summary
Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.
Abstract
Zika Virus (ZIKV) är en framväxande patogen som är kopplad till fosterutvecklings störningar såsom mikrocefali, ögonskador och försämrad tillväxt. ZIKV är ett RNA-virus av Flaviviridae-familjen. ZIKV huvudsak överförs av myggor, men kan också spridas genom moderns till foster vertikal överföring samt sexuell kontakt. Hittills finns det inga tillförlitliga behandling eller vaccin alternativ för att skydda dem smittats av viruset. Utvecklingen av en reproducerbar, effektiv Zika virus smittcellodlingssystem är avgörande för att studera de molekylära mekanismerna för ZIKV replikering samt läkemedel och vaccinutveckling. I detta avseende, är ett protokoll som beskriver en däggdjurscell-baserade in vitro Zika virus odlingssystem för viral produktion och tillväxtanalys redovisas här. Detaljer om bildandet av plack från Zika virus på en cell monolager och plackanalys för att mäta viral titer presenteras. Viral genomreplikation kinetikoch dubbelsträngade RNA-genomet replicatory intermediärer bestäms. Denna kultur plattform användes för att skärmen mot ett bibliotek av en liten uppsättning av cytokiner som resulterar i identifiering av interferon-α (IFN-α), IFN-β och IFN-γ som potenta inhibitorer av Zika virustillväxt. Sammanfattningsvis är ett in vitro smittsam Zika virusodlingssystemet och olika virologiska analyser visade i denna studie, som har potential att kraftigt gynna forskarvärlden i ytterligare klarlägga mekanismerna för viral patogenes och utvecklingen av viral virulens. Antiviral IFN-alfa kan vidare utvärderas som en profylaktisk, efter exponering profylaktisk och behandlingsalternativ för Zika virusinfektioner i högriskgrupper, inklusive infekterade gravida kvinnor.
Introduction
Zika Virus (ZIKV) är en viktig mänsklig patogen i samband med mikrocefali och dålig pregnancyutfall 1,4. ZIKV tillhör uppsättningen av medicinskt relevanta flavivirus som kan orsaka neurologiska defekter såsom Dengue, West Nile och St. Louis encefalitvirus. Det viktigaste sättet för virusöverföring är av mygga vektor Aedes aegypti, och dessutom har sexuell överföring också rapporterats 5,6. ZIKV har blivit en stor global hälsofråga på grund av den växande geografiska fördelningen av mygga vektor och dess stark korrelation med fosterskador. ZIKV isolerades först 1947 från en vaktpost rhesusapa i Zika skogen, var Uganda och den första mänskliga fallet rapporterades 1952 7,8. Individer som blir infekterade med ZIKV närvarande med milda symtom som feber, hudutslag, huvudvärk, konjunktivit, och muskel / ledvärk. Smittade gravida kvinnor kan överföra ZIKV till fostret 1. ZIKV infektion har också varit knuten till Guillain-Barrés syndrom, en perifer nerv autoimmun demyelinisering störning 9.
Den Zika virala genomet består av en positiv känsla, enkelsträngad RNA-molekyl som är omkring 10,8 kilobaser i längd. Genomet struktur är organiserad som 5'NCR-C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-2K-NS4B-NS5-3'NCR, med icke-kodande regioner (NCR) som flankerar en proteinkodande region 6. En enda polyprotein (3419 aa) översätts som är sam- och post-translationellt klyvs till 10 mindre peptider. Både 5'NCR och 3'NCR RNA stam-slingstrukturer spelar en viktig del i inledningen av virala genomet översättning och replikering. De strukturella komponenterna i genomet består av de kapsid, membran, och höljesproteiner. De icke-strukturella proteinerna är kritiska för genomreplikation.
För närvarande är Zika virusstammar delas in i tre huvud genotyper: Västafrikanska, Östafrikanska och asiatiska 6,10-13. Det har föreslagits att den östafrikanska härstamning spridit sig till Västafrika och Asien, där den senare utvecklats 12 ytterligare. Den asiatiska genotyp är ansvarig för den aktuella utbrott i Amerika. Zika virus kan odlas i både mygga och däggdjursceller. Primära dermala fibroblaster, omogna dendritiska celler, kortikala neurala stamceller, och Vero-celler är känsliga för Zika virusinfektion 10,14,15. Både typ I- och typ Il-interferoner har visat sig begränsa ZIKV tillväxt i hudfibroblaster 15. Målen för denna studie är att ge en stegvis, detaljerat protokoll för produktion och testmetoder av den asiatiska genotyp Zika virusstam PRVABC59 i en däggdjurscellodlingssystem och för att demonstrera nyttan av denna smitt odlingssystem som en drog utvecklingsplattform. Denna resurs har potential att kraftigt gynna Zika virus och neurologisk forskning samfundet att ytterligare belysa its mekanismer för viral patogenes och utvecklingen av viral virulens.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här är en strömlinjeformad protokoll för odling Zika virus in vitro presenteras. Kritiska steg inklusive identifiera optimala slutpunkter för att expandera virusodling, mäta titer, och kvantifiera genom replikering tillhandahölls. Zika virus är en human patogen, så vid hantering smittämnen, biosäkerhet förfaranden som måste följas. En apa njurcellinjen, Vero, användes för att demonstrera olika virologiska analyser. Zika viral replikering kinetik kan skilja sig i celler i olika vävnader och arte…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Aaron Brault and Dr. Brandy Russell of the Centers for Disease Control and Prevention (CDC), USA for providing Zika viral strain PRVABC59. We thank Nicholas Ten of Yale University for copy-editing this manuscript. This work was supported by the Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Award to V.A.
Materials
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma Life Science | D5796 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| 2.5% Trypsin, 10X [-] Phenol Red | Corning | 25-054-C1 | |
| Trypan Blue Stain 0.4% | Life Technologies | T10282 | |
| Countess – Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | C10227 | |
| Countess-cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10283 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
| mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2 | English & Scientific Consulting Kft. | 10010200 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11020 | |
| SUPERSCRIPT III RT | Life Technologies | 18080085 | |
| SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX | Life Technologies | 11744500 | |
| QuantStudio12K Flex Real-Time PCR System | Thermo Fischer | 4471088 | |
| RNase-Free DNase | Promega | M6101 | |
| Vero Cell Line | ATCC | CCL-81 | |
| Zika viral strain PRVABC59 | Centers for Disease Control and Prevention (CDC) | ||
| IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
| IL-1 alpha | Peprotech | 200-01A | |
| TNF-alpha | Peprotech | 300-01A | |
| Interferon alpha A | R & D Systems | 11100-1 | |
| Interferon beta | Peprotech | 300-02BC | |
| Interferon gamma | Peprotech | 300-02 | |
| Centrifuge 5415R | Eppendorf | 5415R | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5810R | |
| Nikon Eclipse Ti Immunofluorescence Microscope with Nikon Intenselight C-HGFI | Nikon | Visit Nikon for Request |
References
- Brasil, P., et al. Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro – Preliminary Report. N Engl J Med. , 1-11 (2016).
- Lucey, D. R., Gostin, L. O. The Emerging Zika Pandemic: Enhancing Preparedness. JAMA. 315 (9), 865-866 (2016).
- Mlakar, J., et al. Zika Virus Associated with Microcephaly. N Engl J Med. 374 (10), 951-958 (2016).
- Schuler-Faccini, L., et al. Possible Association Between Zika Virus Infection and Microcephaly. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 65 (3), 59-62 (2015).
- Foy, B. D., et al. Probable non-vector-borne transmission of Zika virus, Colorado, USA. Emerg Infect Dis. 17 (5), 880-882 (2011).
- Kuno, G., Chang, G. J. Full-length sequencing and genomic characterization of Bagaza, Kedougou, and Zika viruses. Arch Virol. 152 (4), 687-696 (2007).
- Dick, G. W. Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 521-534 (1952).
- Dick, G. W., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 509-520 (1952).
- Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome–case report, French Polynesia. Euro Surveill. 19 (9), 1-3 (2013).
- Baronti, C., et al. Complete coding sequence of zika virus from a French polynesia outbreak in 2013. Genome Announc. 2 (3), e00500-e00514 (2014).
- Lanciotti, R. S., et al. Genetic and serologic properties of Zika virus associated with an epidemic, Yap State, Micronesia, 2007. Emerg Infect Dis. 14 (8), 1232-1239 (2008).
- Lanciotti, R. S., et al. Phylogeny of Zika virus in Western Hemisphere, 2015 [Letter]. Emerg Infect Dis. 22 (5), (2016).
- Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area. Clin Microbiol Infect. 20 (10), O595-O596 (2014).
- Tang, H., et al. Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth. Cell Stem Cell. , 1-5 (2016).
- Hamel, R., et al. Biology of Zika Virus Infection in Human Skin Cells. J Virol. 89 (17), 8880-8896 (2015).
- Faye, O., et al. Quantitative real-time PCR detection of Zika virus and evaluation with field-caught mosquitoes. Virol J. 10, 311 (2013).
- Chu, D., et al. Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome. J Virol. 87 (10), 5678-5696 (2013).
- Hiratsuka, M., et al. Administration of interferon-alpha during pregnancy: effects on fetus. J Perinat Med. 28 (5), 372-376 (2000).
- Ozaslan, E., et al. Interferon therapy for acute hepatitis C during pregnancy. Ann Pharmacother. 36 (11), 1715-1718 (2002).
