Zika Virus Infectious Zellkultursystem und die<em> In Vitro</em> Prophylaktische Wirkung von Interferonen
Summary
Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.
Abstract
Zika-Virus (ZIKV) ist eine aufstrebende Erreger, die fetale Entwicklungsstörungen wie Mikrozephalie verbunden ist, Augenfehler und Wachstumsstörungen. ZIKV ist ein RNA – Virus der Familie Flaviviridae. ZIKV wird hauptsächlich durch Stechmücken übertragen, kann aber auch als auch sexuellen Kontakt durch mütterliche fetalen vertikale Übertragung verteilt werden. Bis heute gibt es keine zuverlässige Behandlung oder Impfung Optionen zur Verfügung, die mit dem Virus infiziert zu schützen. Die Entwicklung einer reproduzierbaren, effektive Zika Virus infektiös Zellkultursystem ist von entscheidender Bedeutung für die molekularen Mechanismen der ZIKV Replikation sowie Drogen-und Impfstoff-Entwicklung zu studieren. In dieser Hinsicht ist ein Protokoll einer Säugerzelle basierenden in vitro Zika Viruskultursystem für die virale Produktion und Wachstumsanalyse beschreibt , wird hier berichtet. Einzelheiten zur Bildung von Plaques durch Zika Virus auf einer Zellmonoschicht und Plaque-Assay für Virustiter Messung dargestellt. Viralen Genomreplikation kineticsund doppelsträngigen RNA-Genom replicatory Zwischenprodukte werden bestimmt. Diese Kultur Plattform zum Screenen gegen eine Bibliothek von einer kleinen Gruppe von Cytokinen, was zu der Identifizierung von Interferon-α (IFN-α), IFN-β und IFN-γ als potente Inhibitoren von Zika virales Wachstum genutzt wurde. Zusammengefasst ein in vitro – Infektions Zika Viruskultursystem und verschiedene virologische Tests sind in dieser Studie gezeigt, die das Potenzial hat, die Forschungsgemeinschaft bei der Aufklärung die Mechanismen der viralen Pathogenese und die Entwicklung der viralen Virulenz stark profitieren. Antivirale IFN-alpha kann weiter als Prophylaktikum, Post-Expositions-Prophylaxe zu bewerten und Behandlungsoption für Zika Virusinfektionen in Hochrisikogruppen, einschließlich der infizierten schwangeren Frauen.
Introduction
Zika – Virus (ZIKV) ist eine wichtige menschliche Krankheitserreger im Zusammenhang mit Mikrozephalie und schlechte Schwangerschaft 1,4 Ergebnisse. ZIKV gehört zur Gruppe von medizinisch relevanten Flaviviren, die neurologische Defekte wie das Dengue-Fieber, West-Nil, und St. Louis-Enzephalitis-Viren verursachen können. Der Hauptmodus der viralen Übertragung durch den Moskito – Vektor Aedes aegypti, und zusätzlich hat die sexuelle Übertragung auch 5,6 berichtet. ZIKV hat ein großes globales Gesundheitsproblem geworden aufgrund der wachsenden geographischen Verteilung des Moskito-Vektor und seine starke Korrelation mit Geburtsfehler. ZIKV wurde isoliert zuerst 7,8 im Jahr 1947 von einem Sentinel – Rhesusaffen im Zika Wald, Uganda und der erste Mensch Fall wurde im Jahr 1952 berichtet. Personen, die mit ZIKV mit milden Symptomen vorhanden infiziert werden, wie Fieber, Hautausschlag, Kopfschmerzen, Konjunktivitis und Muskel / Gelenkschmerzen. Infizierte schwangere Frauen können ZIKV auf den sich entwickelnden Fötus 1 übertragen. ZIKV – Infektion hat sich auch Guillain-Barre – Syndrom in Verbindung gebracht worden, einer peripheren Nerven Auto-Immun – Erkrankung Demyelinisierung 9.
Die Zika virale Genom besteht aus einer positiven Sinn, einsträngige RNA-Molekül, das etwa 10,8 Kilobasen lang ist. Die Struktur des Genoms ist als 5'NCR-C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-2K-NS5-3'NCR organisiert, wobei nicht-kodierenden Regionen (NCR) flankieren eine Protein-codierende Region 6. Ein einzelnes Polyprotein (3419 aa) übersetzt wird, dass ist Co- und post-translational in 10 kleinere Peptide gespalten. Sowohl die 5'NCR und 3'NCR RNA-Stem-Loop-Strukturen spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufnahme des viralen Genoms Übersetzung und Replikation. Die strukturellen Komponenten des Genoms der Capsid, Membran besteht und Hüllproteine. Die nicht-strukturellen Proteine sind entscheidend für die Genom-Replikation.
Derzeit sind Zika Virusstämme gruppiert in drei Haupt Genotypen: West African, Ost – Afrika, Asien und 6,10-13. Es hat sich gezeigt , dass die East African Abstammung verbreiten nach Westafrika und Asien vorgeschlagen, wo es später weitere 12 entwickelt. Der asiatische Genotyp ist verantwortlich für die aktuellen Ausbrüche in Nord- und Südamerika. Zika Virus kann sowohl kultiviert werden in Mücke und Säugerzellen. Primäre Hautfibroblasten, unreife dendritische Zellen, kortikalen neuronalen Vorläuferzellen und Vero – Zellen sind empfänglich für eine virale Infektion Zika 10,14,15. Sowohl Typ I und Typ II – Interferonen wurden ZIKV Wachstum in Fibroblasten der Haut 15 gezeigt zu beschränken. Die Ziele dieser Studie sind eine stufenweise, detailliertes Protokoll für die Herstellung und das Testen des asiatischen Genotyp ZIKA Virusstamm PRVABC59 in einer Säugerzellkultursystem zur Verfügung zu stellen und den Nutzen dieser infektiösen Kultursystems als Medikamenten-Entwicklungsplattform zu demonstrieren. Diese Ressource hat das Potenzial, zu stark die Zika virale und neurologische Forschung profitieren weiter i erläuternts Mechanismen der viralen Pathogenese und Entwicklung von viralen Virulenz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier wird eine rationalisierte Protokoll zur Kultivierung Zika Virus in vitro dargestellt. Kritische Schritte, einschließlich Identifizierung optimale Endpunkte für Viruskultur erweitert, Titer zu messen und zu quantifizieren Genomreplikation bereitgestellt wurden. Zika-Virus ist ein menschlicher Krankheitserreger, so, beim Umgang mit infektiösen Erregern, die Biosicherheit Verfahren sind strikt befolgt werden. Ein Affennierenzelllinie, Vero, wurde für den Nachweis verschiedener virologische Tests verwendet…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Aaron Brault and Dr. Brandy Russell of the Centers for Disease Control and Prevention (CDC), USA for providing Zika viral strain PRVABC59. We thank Nicholas Ten of Yale University for copy-editing this manuscript. This work was supported by the Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Award to V.A.
Materials
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma Life Science | D5796 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| 2.5% Trypsin, 10X [-] Phenol Red | Corning | 25-054-C1 | |
| Trypan Blue Stain 0.4% | Life Technologies | T10282 | |
| Countess – Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | C10227 | |
| Countess-cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10283 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
| mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2 | English & Scientific Consulting Kft. | 10010200 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11020 | |
| SUPERSCRIPT III RT | Life Technologies | 18080085 | |
| SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX | Life Technologies | 11744500 | |
| QuantStudio12K Flex Real-Time PCR System | Thermo Fischer | 4471088 | |
| RNase-Free DNase | Promega | M6101 | |
| Vero Cell Line | ATCC | CCL-81 | |
| Zika viral strain PRVABC59 | Centers for Disease Control and Prevention (CDC) | ||
| IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
| IL-1 alpha | Peprotech | 200-01A | |
| TNF-alpha | Peprotech | 300-01A | |
| Interferon alpha A | R & D Systems | 11100-1 | |
| Interferon beta | Peprotech | 300-02BC | |
| Interferon gamma | Peprotech | 300-02 | |
| Centrifuge 5415R | Eppendorf | 5415R | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5810R | |
| Nikon Eclipse Ti Immunofluorescence Microscope with Nikon Intenselight C-HGFI | Nikon | Visit Nikon for Request |
References
- Brasil, P., et al. Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro – Preliminary Report. N Engl J Med. , 1-11 (2016).
- Lucey, D. R., Gostin, L. O. The Emerging Zika Pandemic: Enhancing Preparedness. JAMA. 315 (9), 865-866 (2016).
- Mlakar, J., et al. Zika Virus Associated with Microcephaly. N Engl J Med. 374 (10), 951-958 (2016).
- Schuler-Faccini, L., et al. Possible Association Between Zika Virus Infection and Microcephaly. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 65 (3), 59-62 (2015).
- Foy, B. D., et al. Probable non-vector-borne transmission of Zika virus, Colorado, USA. Emerg Infect Dis. 17 (5), 880-882 (2011).
- Kuno, G., Chang, G. J. Full-length sequencing and genomic characterization of Bagaza, Kedougou, and Zika viruses. Arch Virol. 152 (4), 687-696 (2007).
- Dick, G. W. Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 521-534 (1952).
- Dick, G. W., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 509-520 (1952).
- Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome–case report, French Polynesia. Euro Surveill. 19 (9), 1-3 (2013).
- Baronti, C., et al. Complete coding sequence of zika virus from a French polynesia outbreak in 2013. Genome Announc. 2 (3), e00500-e00514 (2014).
- Lanciotti, R. S., et al. Genetic and serologic properties of Zika virus associated with an epidemic, Yap State, Micronesia, 2007. Emerg Infect Dis. 14 (8), 1232-1239 (2008).
- Lanciotti, R. S., et al. Phylogeny of Zika virus in Western Hemisphere, 2015 [Letter]. Emerg Infect Dis. 22 (5), (2016).
- Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area. Clin Microbiol Infect. 20 (10), O595-O596 (2014).
- Tang, H., et al. Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth. Cell Stem Cell. , 1-5 (2016).
- Hamel, R., et al. Biology of Zika Virus Infection in Human Skin Cells. J Virol. 89 (17), 8880-8896 (2015).
- Faye, O., et al. Quantitative real-time PCR detection of Zika virus and evaluation with field-caught mosquitoes. Virol J. 10, 311 (2013).
- Chu, D., et al. Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome. J Virol. 87 (10), 5678-5696 (2013).
- Hiratsuka, M., et al. Administration of interferon-alpha during pregnancy: effects on fetus. J Perinat Med. 28 (5), 372-376 (2000).
- Ozaslan, E., et al. Interferon therapy for acute hepatitis C during pregnancy. Ann Pharmacother. 36 (11), 1715-1718 (2002).
