Summary

Akış NK Hücre Fonksiyonları İzleme Testi Sitometri tabanlı

Published: October 30, 2016
doi:

Summary

Basit ve güvenilir bir yöntem, örneğin, farklı NK hücresi alt-gruplar içinde degranülasyonu, sitokin ve kemokin üretimi gibi NK hücresi fonksiyonlarının bir dizi analiz için tarif edilmektedir.

Abstract

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and virus-infected or malignantly transformed cells due to a set of germline encoded inhibitory and activating receptors. Upon virus or tumor cell recognition a variety of different NK cell functions are initiated including cytotoxicity against the target cell as well as cytokine and chemokine production leading to the activation of other immune cells. It has been demonstrated that accurate NK cell functions are crucial for the treatment outcome of different virus infections and malignant diseases. Here a simple and reliable method is described to analyze different NK cell functions using a flow cytometry-based assay. NK cell functions can be evaluated not only for the whole NK cell population, but also for different NK cell subsets. This technique enables scientists to easily study NK cell functions in healthy donors or patients in order to reveal their impact on different malignancies and to further discover new therapeutic strategies.

Introduction

doğuştan gelen bağışıklık sistemi doğal katil bir parçası olarak (NK) hücreleri virüs bulaşmış ya da malign hücre transformasyonu karşı ilk savunma hattı katkıda bulunur. inhibe edici ve aktive edici reseptör bir sistem T hücrelerinin aksine önceki antijen astarsız sağlıklı ve dönüştürülmüş hücreler arasında ayrım sağlar. Hedef hücre karşılaşma üzerine NK hücreleri hedeflerini öldürmek için bağışıklık sinaps içine sitotoksik granül (örneğin, perforin, granzymes) içeriğini bırakın. Hedef hücre üzerinde (MIP-1β, örneğin, makrofaj enflamatuar protein 1β) ve kemokinleri:;: Ayrıca, NK hücreleri, farklı sitokin türde (TNF-α, tümör nekroz faktörü-α, IFN-γ, örneğin, interferon-γ) üreten ve salgılayan etkileşimi veya sitokin stimülasyonu 1.

Böyle sitotoksisite, kemokin ve sitokin üretimi yeterli NK hücre fonksiyonları farklı dis kaderi üzerinde önemli bir etkiye sahipkolaylaştırır. Onlar azaltılmış IFN-γ üretimi ve NK hücre reseptörlerini 2 aktive azaltılmış ifade oluşan tanı anındaki bir kusurlu NK hücre profili sergileyen eğer Lösemi hastaları nüks oranları artış göstermektedir. Hedef hücre etkileşimi üzerine sitokin üretimi de dahil olmak üzere, NK hücre sayıları ve fonksiyonu bir erken toparlanma allojenik kök hücre transplantasyonu 3 alan hastalarda azalmış nüks ve sağkalım oranı ile ilişkilidir. Ayrıca, hepatit C virüsü ile enfekte hastalarda interferon tedavisinin başlaması ile periferik NK hücrelerinin degranülasyonu kapasitesi olmayan yanıt 4 daha erken yanıt güçlüdür. NK hücre sayıları (> 80 / ul) lenfoma veya multipl miyelom muzdarip hastalarda otolog kök hücre nakli (autoSCT) gün sonra 15 geliştirilmiş bir ilerlemesinde ve genel sağkalım 5 için öngörü vardır. melanom hastalarında T-hücresi ekspresyonu İmmünoglobulin ve müsin-alan-containing molekül-3 (TİM-3), NK hücreleri üzerinde bağışıklık-düzenleyici protein, bir hastalık aşaması ve prognoz 6 ile bağlantılıdır.

Bilim adamları son yıllarda boyunca NK hücre fonksiyonlarını takip var. Önceden astarsız tümör hücrelerine karşı NK hücre sitotoksisite başlangıç analizi, 51Cr-açığa çıkarma deneyinde 7 ile ele alındı. Daha yakın zamanda, bilim adamları, genişletilmiş NK hücrelerinin 8 sitotoksisitesini değerlendirmek için radyoaktif olmayan bir yöntem geliştirdi. Sitokin ve kemokin üretimi sıklıkla enzim bağlantılı immünosorbent deneyi (ELISA) tekniği 9,10 kullanılarak değerlendirilmiştir. Son yıllarda bu yöntemler flow sitometri tabanlı analizleri ile tamamlanmıştır. Geleneksel yüzey boyama protokolleri ile birlikte protein taşıma inhibitörleri (örneğin, Brefeldin A ve monensin) ve hücre permeabilization yöntemlerinin kullanımı, farklı spesifik lenf kemokin ve sitokin üretimini incelemek için bilim adamları sağladıocyte alt-kümeleri (örneğin, T, B ya da NK hücreleri) 11. Ayrıca, farklı akış sitometri bazlı deneyler T ve NK hücre sitotoksisitesini izlemek için geliştirilmiştir. 2004 Alter ve ark., Sitotoksik granüller 12 degranülasyonunun için bir markör olarak hedef hücre karşılaşıldığında NK hücreleri üzerinde lizozom ilişkili protein CD 107a (LAMP1) yüzey ekspresyonunu tarif. Farklı fluorochromes ve çok kanallı akış sitometrelerinde geniş bir yelpazede günümüzde mevcut olduğundan, aynı anda farklı NK hücre alt gruplarında çeşitli NK hücre fonksiyonlarını (sitotoksisite, sitokin ve kemokin üretimi) izlenmesi mümkün hale gelmiştir. Bu biyopsi veya lökopeni mustarip hastaların kan örneklerinde, örneğin Örnek büyüklüğü sınırlı olduğu durumlarda özellikle önemli hale gelir.

Global NK hücresi fonksiyonlarını test etmek için, farklı akış sitometri bazlı deneyler etkin birleştirilebilir. Theorell ve ark. İşitme cihazı uyarılır NK hücrelerilthy tümör hücre çizgisi K562 ile bağışçıların ve 13 flow sitometri aracılığı ile NK hücre degranülasyonu, iç-dış sinyal ve kemokin üretimini analiz. Son zamanlarda NK hücre alt grupları, autoSCT sırasında fenotipleri ve tümör hastalarında fonksiyonları sitometri tabanlı deneyler akış kullanılarak analiz edildi. Bu NK hücreleri degranüle ve autoSCT 11 sonra çok erken zaman noktalarında tümör hücre tanıma üzerine sitokinler / kemokinleri üretmek mümkün olduğu gösterilmiştir.

Burada bir protokol degranülasyonu kapasitesi, kemokin ve sitokin üretimi dahil olmak üzere tümör hücrelerinin mümkün aynı anda farklı alt NK hücre fonksiyonlarını izlemek için yapan bir akış sitometrisi bazlı analiz kullamlarak etkileşimin ardından NK hücre fonksiyonlarını değerlendirmek için tarif edilmektedir.

Protocol

Bu çalışma Frankfurt Üniversitesi yerel etik kurul önerileri doğrultusunda gerçekleştirilmiştir. K562 hücrelerinin 1. Kültürleme R10 ortam Kültür K562 hücreleri, 37 ° C'de ve% 5 CO bir hücre kültürü şişesi içinde, ml başına 0.5-1 x 10 6 hücre yoğunluğunda (glutamin ortamı,% 1 penisilin / streptomisin,% 10 fetal dana serumu ile RPMI-1640) 2. Hasat K562 Hücreler Yeni deney başlamadan önce 24 saat. inkübatör K562 hücreleri i?…

Representative Results

Bütün NK hücre ve üç farklı NK hücresi alt kümelerinin degranülasyonu, sitokin ve kemokin üretimini analiz etmek için Ayırıcı stratejisi, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Bir sağlıklı donörün Örnek sonuçlar Şekil 2'de gösterilmektedir. Bir uyarıcı olmadan NK hücreleri de IFN-y veya MIP-1 p üretilen ve yüzeyi üzerinde CD 107a (Şekil 2A)…

Discussion

tarif edilen yöntem sağlıklı vericilerden veya hastanın tam kan örnekleri NK hücre fonksiyonlarını incelemek için kolay, hızlı ve güvenilir bir yaklaşımdır. Bu yöntem, kaçınarak doğrudan tam kan NK hücrelerinin saflaştırılması için büyük bir avantaj sunmaktadır zaman alıcı bir çok saflaştırma yöntemleri 15 için zorunlu olan yoğunluk gradyan santrifüjleme. Ayrıca, pediatrik ve / veya bağışıklık eksikliği olan hastalarda örnekler için uygun bir alternatif yapar &qu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Authors were supported by the German Cancer Aid (Max Eder Nachwuchsgruppe, Deutsche Krebshilfe; EU), the LOEWE Center for Cell and Gene Therapy Frankfurt (EU, ST) funded by the Hessian Ministry of Higher Education, Research and the Arts, Germany (III L 4- 518/17.004) and by the “Alfred- und Angelika Gutermuth-Stiftung”, Frankfurt, Germany (EU). BJ was funded by a Mildred Scheel postdoctoral scholarship from the Dr. Mildred Scheel Foundation for Cancer Research. ST was founded by a GO-IN postdoctoral fellowship (PCOFUND-GA-2011-291776). The authors thank Becton Dickinson (BD) for providing the FACSCanto II and Canto10c Flow Cytometry Analyzers used in this study.

Materials

RPMI 1640 + glutamine Invitrogen 6187-044
penicilin/streptomycin Invitrogen 15140-122
BD Falcon Round Bottom Tube BD 352008
fetal calf serum Invitrogen 10270-106 heat inactivated before use
T-flask Greiner Bio-One 690195
K562 tumor cell line DSMZ GmbH ACC 10
ammonium-chloride-potassium (ACK) lysis buffer made in house / components are listed in the text
Distilled water: Ampuwa Spüllösung 1000ml Plastipur Fresenius Kabi 1088813
Megafuge 40R Centrifuge Heraeus /
EDTA blood collector tubes Sarstedt 386453 S-Monovette 7,5 ml, K3 EDTA
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 Life Technologies 15575-020
Hematopoietic media (XVIVO) Lonza Group Ltd BE04-743Q
human serum DRK Blutspendedienst, Frankfurt/M  / healthy donors with blood type AB; heat inactivated before use
Neubauer-improved counting chamber, bright line Marienfeld superior/ LO-Laboroptik Ltd. 0640030/ 1110000
trypan blue solution (0,4%) Invitrogen 15250-061
3% acetic acid with methylene blue Stemcell Technologies  07060
Corning 96 Well Clear V-Bottom TC-treated Microplates Corning  3894
Falcon 96 Well Round Bottom Not Treated Microplates Corning  351177
DPBS (Ca2+– and Mg2+-free) Gibco Invitrogen 14190-169
BSA Sigma Aldrich A2153-100G
NaN3 Sigma Aldrich 08591-1ML-F
phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)  Merck 524400-1MG
ionomycin  PromoKine PK-CA577-1566-5
interleukin 15 (IL-15) PeproTech 200-15
Proleukin S (IL-2)  Novartis Pharma 730523
Golgi Stop, Protein Transport Inhibitor (containing Monensin) BD Biosciences 554724 This product can be used in combination or instead of Golgi Plug. The best combination for the wished experimental setting has to be tested.
Golgi Plug, Protein Transport Inhibitor (containing Brefeldin A) BD Biosciences 555029
paraformaldehyde AppliChem UN2209
saponin Sigma Aldrich 47036
flow cytometer: Canto10C BD Biosciences /
FlowJo TreeStar Inc. /
Graph Pad Graph Pad Inc. /
MACSxpress Separator Miltenyi Biotec  130-098-308
MACSxpress NK isolation kit Miltenyi Biotec  130-098-185
MACSxpress Erythrocyte Depletion Kit, human Miltenyi Biotec  130-098-196
MACSmix Tube Rotator  Miltenyi Biotec  130-090-753
anti-human CD3 APC Biolegend 300412
anti-human CD3 V450 BD Biosciences 560366
anti-human CD14 PerCP Miltenyi Biotec  130-094-969
anti-human CD14 V450 BD Biosciences 560349
anti-human CD16 PE Biolegend 302008
anti-human CD16 PerCP Biolegend 302029
anti-human CD19 PE-Cy7 Biolegend 302216
anti-human CD19 V450 BD Biosciences 560353
anti-human CD45 BV510 BD Biosciences 563204
anti-human CD56 FITC Biolegend 345811
anti-human CD107a PE Biolegend 328608
anti-human IFN-γ AF-647 BD Biosciences 557729
anti-human MIP-1β APC-H7 BD Biosciences 561280
DAPI Biolegend 422801
Zombie Violet Fixable Viability Kit Biolegend 423113 fixable dead cell marker

References

  1. Watzl, C. How to trigger a killer: modulation of natural killer cell reactivity on many levels. Adv Immunol. 124, 137-170 (2014).
  2. Khaznadar, Z., et al. Defective NK Cells in Acute Myeloid Leukemia Patients at Diagnosis Are Associated with Blast Transcriptional Signatures of Immune Evasion. J Immunol. 195 (6), 2580-2590 (2015).
  3. Pical-Izard, C., et al. Reconstitution of natural killer cells in HLA-matched HSCT after reduced-intensity conditioning: impact on clinical outcome. Biol Blood Marrow Transplant. 21 (3), 429-439 (2015).
  4. Ahlenstiel, G., et al. Early changes in natural killer cell function indicate virologic response to interferon therapy for hepatitis C. Gastroenterology. 141 (4), 1231-1239 (2011).
  5. Porrata, L. F., et al. Early lymphocyte recovery predicts superior survival after autologous stem cell transplantation in non-Hodgkin lymphoma: a prospective study. Biol Blood Marrow Transplant. 14 (7), 807-816 (2008).
  6. Silva, I. P., et al. Reversal of NK-cell exhaustion in advanced melanoma by Tim-3 blockade. Cancer Immunol Res. 2 (5), 410-422 (2014).
  7. Kiessling, R., Klein, E., Wigzell, H. “Natural” killer cells in the mouse. I. Cytotoxic cells with specificity for mouse Moloney leukemia cells. Specificity and distribution according to genotype. Eur J Immunol. 5 (2), 112-117 (1975).
  8. Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells. J Vis Exp. (48), (2011).
  9. Mariani, E., et al. Chemokine production by natural killer cells from nonagenarians. Eur J Immunol. 32 (6), 1524-1529 (2002).
  10. Reefman, E., et al. Cytokine secretion is distinct from secretion of cytotoxic granules in NK cells. J Immunol. 184 (9), 4852-4862 (2010).
  11. Jacobs, B., et al. NK Cell Subgroups, Phenotype, and Functions After Autologous Stem Cell Transplantation. Front. Immunol. 6, 583 (2015).
  12. Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. J Immunol Methods. 294 (1-2), 15-22 (2004).
  13. Theorell, J., et al. Sensitive and viable quantification of inside-out signals for LFA-1 activation in human cytotoxic lymphocytes by flow cytometry. J Immunol Methods. 366 (1-2), 106-118 (2011).
  14. Brander, C., et al. Inhibition of human NK cell-mediated cytotoxicity by exposure to ammonium chloride. J Immunol Methods. 252 (1-2), 1-14 (2001).
  15. Beeton, C., Chandy, K. G. Enrichment of NK cells from human blood with the RosetteSep kit from StemCell technologies. J Vis Exp. (8), e326 (2007).
  16. Lamoreaux, L., Roederer, M., Koup, R. Intracellular cytokine optimization and standard operating procedure. Nat. Protoc. 1 (3), 1507-1516 (2006).
  17. Baginska, J., et al. Granzyme B degradation by autophagy decreases tumor cell susceptibility to natural killer-mediated lysis under hypoxia. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (43), 17450-17455 (2013).
  18. He, L., et al. A sensitive flow cytometry-based cytotoxic T-lymphocyte assay through detection of cleaved caspase 3 in target cells. J Immunol Methods. 304 (1-2), 43-59 (2005).
  19. Sutton, V. R., et al. Serglycin determines secretory granule repertoire and regulates NK cell and CTL cytotoxicity. FEBS J. 283 (5), 947-961 (2016).
  20. Schönberg, K., Hejazi, M., Uhrberg, M. Protocol for the clonal analysis of NK cell effector functions by multi-parameter flow cytometry. Methods Mol Biol. 903, 381-392 (2012).
  21. Björkström, N. K., et al. Expression patterns of NKG2A, KIR, and CD57 define a process of CD56dim NK-cell differentiation uncoupled from NK-cell education. Blood. 116 (19), 3853-3864 (2010).
  22. Bryceson, Y. T., Ljunggren, H. G., Long, E. O. Minimal requirement for induction of natural cytotoxicity and intersection of activation signals by inhibitory receptors. Blood. 114 (13), 2657-2666 (2009).
  23. Cooper, M. A., et al. Human natural killer cells: a unique innate immunoregulatory role for the CD56(bright) subset. Blood. 97 (10), 3146-3151 (2001).
  24. Fauriat, C., Long, E. O., Ljunggren, H. G., Bryceson, Y. T. Regulation of human NK-cell cytokine and chemokine production by target cell recognition. Blood. 115 (11), 2167-2176 (2010).
  25. Postow, M. A., Callahan, M. K., Wolchok, J. D. Immune Checkpoint Blockade in Cancer Therapy. J Clin Oncol. 33 (17), 1974-1982 (2015).
  26. Glienke, W., et al. Advantages and applications of CAR-expressing natural killer cells. Front Pharmacol. 6, 21 (2015).
  27. Curran, K. J., Brentjens, R. J. Chimeric antigen receptor T cells for cancer immunotherapy. J Clin Oncol. 33 (15), 1703-1706 (2015).
  28. Zappasodi, R., de Braud, F., Di Nicola, M. Lymphoma Immunotherapy: Current Status. Front. Immunol. 6, 448 (2015).
  29. Laprevotte, E., et al. Endogenous IL-8 acts as a CD16 co-activator for natural killer-mediated anti-CD20 B cell depletion in chronic lymphocytic leukemia. Leuk Res. 37 (4), 440-446 (2013).
  30. Maloney, D. G., et al. IDEC-C2B8 (Rituximab) anti-CD20 monoclonal antibody therapy in patients with relapsed low-grade non-Hodgkin’s lymphoma. Blood. 90 (6), 2188-2195 (1997).
  31. Salles, G., et al. Phase 1 study results of the type II glycoengineered humanized anti-CD20 monoclonal antibody obinutuzumab (GA101) in B-cell lymphoma patients. Blood. 119 (22), 5126-5132 (2012).
  32. Terszowski, G., Klein, C., Stern, M. KIR/HLA interactions negatively affect rituximab- but not GA101 (obinutuzumab)-induced antibody-dependent cellular cytotoxicity. J Immunol. 192 (12), 5618-5624 (2014).
  33. Hsu, A. K., et al. The immunostimulatory effect of lenalidomide on NK-cell function is profoundly inhibited by concurrent dexamethasone therapy. Blood. 117 (5), 1605-1613 (2011).
  34. Salih, J., et al. The BCR/ABL-inhibitors imatinib, nilotinib and dasatinib differentially affect NK cell reactivity. Int J Cancer. 127 (9), 2119-2128 (2010).
  35. Benson, D. M., et al. A phase 1 trial of the anti-KIR antibody IPH2101 in patients with relapsed/refractory multiple myeloma. Blood. 120 (22), 4324-4333 (2012).
  36. Vey, N., et al. A phase 1 trial of the anti-inhibitory KIR mAb IPH2101 for AML in complete remission. Blood. 120 (22), 4317-4323 (2012).
  37. Terme, M., Ullrich, E., Delahaye, N. F., Chaput, N., Zitvogel, L. Natural killer cell-directed therapies: moving from unexpected results to successful strategies. Nat Immunol. 9 (5), 486-494 (2008).

Play Video

Cite This Article
Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions. J. Vis. Exp. (116), e54615, doi:10.3791/54615 (2016).

View Video