Summary

ل<em> في المختبر</em> نموذج من حاجز الدم في الدماغ عن طريق التحليل الطيفي المعاوقة: التركيز على التفاعل خلية تي خلية البطانية

Published: December 08, 2016
doi:

Summary

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

Abstract

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not naïve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

Introduction

حاجز الدم في الدماغ يفصل جهاز الدورة الدموية من الجهاز العصبي المركزي (CNS) 1-3. وهو يوفر حاجز مادي أن يمنع حرية حركة الخلايا وانتشار الجزيئات القابلة للذوبان في الماء ويحمي الدماغ من مسببات الأمراض والمواد الضارة المحتملة. بالإضافة إلى وظيفة الجدار العازل، وBBB تمكن من إيصال الأوكسجين والمواد المغذية لحمة الدماغ، والتي تضمن حسن سير العمل في الأنسجة العصبية. الخصائص الفنية للBBB درجة عالية من التنظيم من قبل المكونات الخلوية وديكي لها، مع درجة عالية من التخصص ECS كونها العنصر الهيكلي الرئيسي. تتميز ECS من BBB من وجود تقاطع ضيق (TJ) المجمعات، وعدم وجود fenestrations، النشاط pinocytic منخفضة للغاية، وآليات النقل نشطة بشكل دائم. مكونات أخرى من BBB الغشاء القاعدي EC، pericytes تضمين البطانة، قدم نهاية نجمي و= المرتبطة قدم المساواةenchymal الغشاء القاعدي أيضا أن تسهم في تطوير وصيانة وظيفة من BBB 2،4 6 و، جنبا إلى جنب مع الخلايا العصبية والخلايا الدبقية الصغيرة، تشكل وحدة وعائية عصبية (NVU)، والتي تمكن حسن سير العمل في الجهاز العصبي المركزي 7-9.

في مجموعة متنوعة من الأمراض العصبية، مثل الاعصاب، والأمراض الالتهابية أو المعدية، وظيفة BBB للخطر 2،5،10. ديسريغولاتيون من TJ المجمعات وآليات النقل الجزيئية يؤدي إلى زيادة نفاذية BBB، تسرب الكريات البيض، والتهاب وتلف الخلايا العصبية. من أجل دراسة خصائص BBB في ظل هذه الظروف المرضية، وقد وضعت مختلف في المختبر نماذج BBB 9،11،12. معا كانوا قد قدموا معلومات قيمة حول التغييرات النزاهة الحاجز، نفاذية وكذلك آليات النقل. هذه النماذج تستخدم الخلايا البطانية من البشر، الجرذان والفئران، الخنزير أو بالأغنام أصل 13-18. الخلايا البطانية الأولية أو خطوط الخلايا يتم استزراع إما الأحادية أو جنبا إلى جنب مع pericytes و / أو الخلايا النجمية لتحاكي بشكل وثيق BBB في الجسم الحي 19-25. في السنوات الأخيرة، أصبح قياس المقاومة الكهربائية transendothelial (طير) أداة مقبولة على نطاق واسع لتقييم خصائص حاجز غشائي 26،27.

يعكس طير مقاومة لتدفق الأيونات عبر أحادي الطبقة الخلية ويوفر انخفاضه مقياس حساسية للخطر سلامة حاجز غشائي، وبالتالي زيادة نفاذية. وقد وضعت العديد من أنظمة قياس طير، بما في ذلك طلائي Voltohmmeter (EVOM)، الكهربائية الخلوي الركيزة الممانعة الاستشعار (ECIS)، وتحليل الخلايا في الوقت الحقيقي 15،28 30. يعكس طير المقاومة لتدفق الأيونات بين ECS المجاورة (paracellular الطريق) وهو يتناسب طرديا معسلامة الحاجز. في مقاومة الطيفي 27،31، يتم قياس مقاومة الإجمالية المعقدة (Z)، الذي يوفر معلومات إضافية حول سلامة الحاجز عن طريق قياس جنة علم المناخ. لجنة علم المناخ يتعلق بالسعة الحالية من خلال غشاء الخلية (الطريق العابر لل): طبقة الخلايا تتصرف مثل مكثف في الدائرة الكهربائية ما يعادلها، فصل رسوم على جانبي الغشاء وهي عكسيا يتناسب مع سلامة الحاجز. عندما نمت على إدراج قابلة للاختراق، ECS الالتزام بها وتتكاثر وتنتشر على غشاء الصغيرة التي يسهل اختراقها. هذا يقاوم الخلفية بالسعة الحالية للإدراج (الذي في حد ذاته يتصرف مثل مكثف) ويؤدي إلى انخفاض في السعة حتى يصل إلى مستوى الحد الأدنى. ويعقب ذلك من خلال إنشاء مجمعات TJ أن ختم قبالة الفضاء بين ECS المجاورة. وهذا يحد من تدفق الأيونات عبر الطريق paracellular، وطير يزيد حتى يصل إلى هضبة لها. في ظل ظروف التهابات، ومع ذلك، فإن endotheliتم المساس آل الحاجز: طير يتناقص مجمعات TJ الحصول على تعطلت ولجنة علم المناخ يزيد باعتبارها العنصر بالسعة من إدراج يرتفع مرة أخرى.

يستخدم قياس طير لدينا نظام آلي مراقبة الخلية 32: يترتب على مبدأ التحليل الطيفي مقاومة وتمتد تطبيقاته السابقة. هنا، نحن تصف في المختبر نموذج BBB التي تمكن من دراسة خصائص الحاجز، بما فيها تفاعل بطانة الدماغ مع الخلايا المناعية. ولا سيما تنشيط خلايا تي. ولوحظت هذه الظروف المرضية في أمراض المناعة الذاتية في الجهاز العصبي المركزي، مثل التصلب المتعدد ونموذج حيواني التجريبية التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي في 33-37. هنا، خطوة حاسمة هي التهجير من دماغي المنشأ، وخلايا T-المايلين محددة عبر BBB. ويتبع ذلك تنشيط في الحيز المحيط بالأوعية ودخول حمة الدماغ، حيث تجنيد الخلايا المناعية الأخرى، وليالتهاب diate ولاحق إزالة الميالين 1،35،38. ومع ذلك، الآليات الجزيئية للتفاعل بين هذه الخلايا التائية والخلايا البطانية، والمكونات الرئيسية من بي بي بي، ليست مفهومة جيدا. ويهدف بروتوكول لدينا لملء هذه الفجوة وإعطاء رؤى جديدة في العواقب على الخلايا البطانية (أي سلامة الحاجز والنفاذية) عند الاتصال بهم مباشرة وتفاعل معقد مع تنشيط خلايا تي.

بروتوكول الموصوفة هنا يجعل من استخدام الماوس الأساسي خلايا الاوعية الدموية الدقيقة في الدماغ البطانية، كما نمت أحادي الطبقة على إدراج نفاذية الأغشية مع الصغيرة التي يسهل اختراقها. وشارك في تربيتها الخلايا البطانية مع خلايا CD4 + T، التي يمكن أن تكون مرحلة ما قبل تفعيلها إما polyclonally أو بطريقة مستضد معين. شارك في ثقافة MBMECs مع خلايا T قبل تفعيلها، ولكن ليس ساذجا يؤدي الى انخفاض في طير وزيادة في لجنة علم المناخ، والذي يقدم مقياسا كميا لMBMEC الخلل وحاجز انقطاع. التقنيةهو غير الغازية: ويستخدم في البناء بدلا من الأقطاب الكهربائية عود، التي تحول دون اضطراب كبير من أحادي الطبقة EC. أنها يمكن أن تستخدم لمراقبة وظيفة الحاجز من دون استخدام علامات الخلية. يجعل القياسات المستمرة بطريقة آلية وتمكن تقييم مستقل من المعلمات حاجز اثنين (طير ولجنة علم المناخ) في وقت واحد مع مرور الوقت. هذه الطريقة أيضا حساسة بما يكفي للتمييز بين مستويات مختلفة من تنشيط الخلايا T وآثار هذه الخلايا التائية على ECS.

ويمكن استخدامه في مجموعة واسعة من المقايسات الفنية: السيتوكينات مختلفة و / أو كيموكينات المتورطين في عمليات التهابات يمكن أن تضاف إلى ثقافة مشتركة من MBMECs وخلايا تي. منع الأجسام المضادة ضد جزيئات التصاق الخلية على أي من المفوضية الأوروبية أو الجانب تي خلية يمكن استخدامها. ومثبطات تي علامات تنشيط الخلايا أو ممتلكاتهم لحل الخلايا يمكن أن تضاف خلال فتيلة تي خلية أو زملائهم في الثقافة مع ECS. الفحص مفيد أيضا للهجرة خلايا Tالمقايسات، لأنها يمكن أن تكون بمثابة مراقبة جودة MBMEC سلامة أحادي الطبقة السابقة لإضافة خلايا تي. كل هذا يجعل هذه الطريقة أداة مرنة وموثوق بها لدراسة BBB في المختبر، مع التركيز على تأثير تنشيط خلايا تي في المفوضية الأوروبية سلامة أحادي الطبقة. هذا الأمر أهمية خاصة لفهم آليات تعطل BBB في التسبب في أمراض المناعة الذاتية، مثل مرض التصلب العصبي المتعدد ونموذج حيواني لEAE، حيث تعبر، وخلايا T دماغي المنشأ ذاتية التفاعل بي بي بي وتسبب التهاب وتلف الخلايا العصبية.

Protocol

لجميع التجارب، كانت ولدت الفئران والمحافظة في ظل ظروف معينة خالية من مسببات الأمراض في منشأة الحيوان المركزي في جامعة مونستر، وفقا للمبادئ التوجيهية الألمانية لرعاية الحيوانات. تم إجراء جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة الحيوان الأخلاق التجريبية والموافقة عليها من ق…

Representative Results

ويقدم الشكل 1 لمحة عامة عن نموذج BBB في المختبر تستخدم لدراسة التفاعل بين الخلايا T والخلايا البطانية. وتتكون هذه التجربة من ثلاث خطوات رئيسية. الخطوة الأولى هي عزل MBMECs الابتدائي من القشور الدماغ، وثقافتهم لمدة خمسة أيام. عندما تصل إلى ن?…

Discussion

عدة خطوات من بروتوكول صفها ضرورية لإجراء تجربة ناجحة. خلال العزلة MBMEC الأولية والثقافة، فمن الأهمية بمكان أن يتم تنفيذ العمل تحت ظروف معقمة قدر الإمكان، لمنع التلوث من ثقافة الخلية مع الجراثيم الفطرية أو البكتيريا. من أجل الحصول على ثقافة نقية من ECS، فمن المستحسن است?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ونحن ممتنون لأنيكا Engbers وفرانك كورث حصول على الدعم الفني الممتاز والدكتور ماركوس شافر (nanoAnalytics GmbH ل) لإجراء مناقشات مفيدة بشأن القياسات طير. وأيد هذا العمل من قبل جمعية الألمانية للبحوث (DFG)، SFB1009 مشروع A03 إلى الأب وLK، CRC TR128، مشاريع A08. Z1 وB01 لوقا والأب، ومركز متعدد التخصصات للبحوث السريرية (كلية الطب في مونستر) عدد المنح Kl2 / 2015/14 لوقا.

Materials

cellZscope nanoAnalytics GmbH www.nanoanalytics.com including: 24-well Cell Module, Controller, PC with cellZscope software v2.2.2 
Ultracentrifuge Thermo Scientific www.thermoscientific.com SORVALL RC 6+; rotor F21S-8x50y; for MBMEC isolation
flow cytometer Beckman Coulter www.beckmancoulter.com for analysis of T cell transmigration
FlowJo7.6.5 software Tree Star www.flowjo.com for analysis of T cell transmigration
Oak Ridge centrifuge tubes, PC Thermo Fisher Scientific 3118-0050 50 ml; for MBMEC isolation
Transwell membrane inserts – pore size 0.4 µm Corning 3470 for TEER measurement as the main readout
Transwell membrane inserts – pore size 3 µm Corning 3472 for TEER measurement as the quality control prior to T-cell transmigration assay
24-well cell culture plate Greiner 650 180 flat-bottom; for MBMEC culture
96-well cell culture plate Costar 3526 round-bottom; for immune cell culture
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotec 130-090-976 for T cell and B cell isolation; supports MACS LS columns
OctoMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-109 for dendritic cell isolation; supports MACS MS columns
Neubauer counting chamber Marienfeld MF-0640010 for cell counting
Cell strainer, 70 µm Corning 352350 for immune cell isolation
Cell strainer, 40 µm Corning 352340 for immune cell isolation
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303 for immune cell isolation
MACS LS separation columns Miltenyi Biotec 130-042-401 for T cell and B cell isolation
MACS MS separation columns Miltenyi Biotec 130-042-201 for dendritic cell isolation
Mouse CD4 MicroBeads Miltenyi Biotec 130-049-201 for CD4+ T cell isolation
Mouse CD19 MicroBeads Miltenyi Biotec 130-052-201 for B cell isolation
Mouse CD11c MicroBeads Miltenyi Biotec 130-052-001 for dendritic cell isolation
Collagen type IV from human placenta Sigma C5533 for MBMEC coating solution
Fibronectin from bovine plasma Sigma F1141-5MG for MBMEC coating solution
Collagenase 2 (CSL2) Worthington LS004176 for MBMEC isolation
Collagenase/Dispase (C/D) Roche 11097113001 for MBMEC isolation
DNase I Sigma DN25 for MBMEC isolation
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F7524 for MBMEC isolation
Bovine Serum Albumin (BSA) Amresco 0332-100G for MBMEC isolation
Percoll Sigma P1644-1L for MBMEC isolation
DMEM (+ GlutaMAX) Gibco 31966-021 for MBMEC isolation and MBMEC culture medium
Penicillin/Streptomycin Sigma P4333 for MBMEC isolation and MBMEC culture medium
Phosphate-Buffered Saline (PBS) Sigma D8537 for MBMEC and immune cell isolation
Heparin Sigma H3393 for MBMEC culture medium
Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) PeproTech 100-18B for MBMEC culture medium
Puromycin Sigma P8833 for MBMEC culture medium; only for the first three days
0.05% Trypsin-EDTA Gibco 25300-054 for harvesting MBMECs
Collagenase Type IA Sigma C9891 for dendritic cell isolation
Trypan Blue solution, 0.4% Thermo Fisher Scientific 15250061 for cell counting
EDTA Sigma E5134 for immune cell isolation
IMDM + 1% L-Glutamin Gibco 21980-032 for T cell culture medium
X-VIVO 15 Lonza BE04-418Q protect from light; for B cell culture medium
β-mercaptoethanol Gibco 31350-010 for B cell culture medium
L-Glutamine (100x Glutamax) Gibco 35050-061 for B cell culture medium
mouse MOG35—55 peptide Biotrend BP0328 for antigen-specific T cell activation
purified anti-mouse CD3 Ab BioLegend 100302 clone 145-2C11; for polyclonal T cell activation
purified NA/LE anti-mouse CD28 Ab BD Pharmingen 553294 clone 37.51; for polyclonal T cell activation
Recombinant Murine IFN-γ PeproTech 315-05 for T-cell transmigration assays
Recombinant Murine TNF-α PeproTech 315-01A for T-cell transmigration assays
NA/LE purified anti-mouse IFN-γ antibody BD Biosciences 554408 clone XMG1.2; recommended final concentration: 20 µg/ml
Granzyme B Inhibitor II Calbiochem 368055 recommended final concentration: 10 µM
PE anti-mouse CD4 antibody Biolegend 116005 clone RM4-4; for analysis of T cell transmigration

References

  1. Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Semin Immunopathol. 31 (4), 497-511 (2009).
  2. Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nat Med. 19 (12), 1584-1596 (2013).
  3. Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. 37 (1), 13-25 (2010).
  4. Luissint, A. -. C., Artus, C., Glacial, F., Ganeshamoorthy, K., Couraud, P. -. O. Tight junctions at the blood brain barrier: physiological architecture and disease-associated dysregulation. Fluids Barriers CNS. 9 (1), 23 (2012).
  5. Zlokovic, B. V. The Blood-Brain Barrier in Health and Chronic Neurodegenerative Disorders. Neuron. 57, 178-201 (2008).
  6. Armulik, A., Genové, G., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
  7. Stanimirovic, D. B., Friedman, A. Pathophysiology of the neurovascular unit: disease cause or consequence?. J Cereb Blood Flow Metab. 32 (7), 1207-1221 (2012).
  8. Hawkins, B. T., Davis, T. P. The Blood-Brain Barrier / Neurovascular Unit in Health and Disease. Pharmacol Rev. 57 (2), 173-185 (2005).
  9. Cardoso, F. L., Brites, D., Brito, M. A. Looking at the blood-brain barrier: molecular anatomy and possible investigation approaches. Brain Res Rev. 64 (2), 328-363 (2010).
  10. Weiss, N., Miller, F., Cazaubon, S., Couraud, P. -. O. The blood-brain barrier in brain homeostasis and neurological diseases. Biochim Biophys Acta. 1788 (4), 842-857 (2009).
  11. Deli, M. A., Ábrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: Physiology, pathology, and pharmacology. Cell Mol Neurobiol. 25 (1), 59-127 (2005).
  12. Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (1), 113-128 (2011).
  13. Bernas, M. J., Cardoso, F. L., et al. Establishment of primary cultures of human brain microvascular endothelial cells to provide an in vitro cellular model of the blood-brain barrier. Nat Protoc. 5 (7), 1265-1272 (2010).
  14. Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells. J Vis Exp. (93), e52204 (2014).
  15. Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport. J Vis Exp. (88), (2014).
  16. Eigenmann, D. E., Xue, G., Kim, K. S., Moses, A. V., Hamburger, M., Oufir, M. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids Barriers CNS. 10 (1), (2013).
  17. Patabendige, A., Skinner, R. A., Morgan, L., Abbott, N. J. A detailed method for preparation of a functional and flexible blood-brain barrier model using porcine brain endothelial cells. Brain Res. 1521, 16-30 (2013).
  18. Burek, M., Salvador, E., Förster, C. Y. Generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model. J Vis Exp. (66), e4022 (2012).
  19. Thanabalasundaram, G., Schneidewind, J., Pieper, C., Galla, H. J. The impact of pericytes on the blood-brain barrier integrity depends critically on the pericyte differentiation stage. Int J Biochem Cell Biol. 43 (9), 1284-1293 (2011).
  20. Abbott, N. J., Dolman, D. E. M., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An Improved in vitro BBB model: RBEC co-cultured with astrocytes. Methods Mol Biol. 814, 415-430 (2012).
  21. Sansing, H. A., Renner, N. A., MacLean, A. G. An inverted blood-brain barrier model that permits interactions between glia and inflammatory stimuli. J Neurosci Methods. 207 (1), 91-96 (2012).
  22. Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. J Neurosci Methods. 199 (2), 223-229 (2011).
  23. Xue, Q., Liu, Y., et al. A novel brain neurovascular unit model with neurons, astrocytes and microvascular endothelial cells of rat. Int J Biol Sci. 9 (2), 174-189 (2013).
  24. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  25. Nakagawa, S., Deli, M. A., et al. Pericytes from Brain Microvessels Strengthen the Barrier Integrity in Primary Cultures of Rat Brain Endothelial Cells. Cell Mol Neurobiol. 27 (6), 687-694 (2007).
  26. Srinivasan, B., Kolli, A. R., Esch, M. B., Abaci, H. E., Shuler, M. L., Hickman, J. J. TEER Measurement Techniques for In Vitro Barrier Model Systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
  27. Benson, K., Cramer, S., Galla, H. -. J. Impedance-based cell monitoring: barrier properties and beyond. Fluids and barriers of the CNS. 10 (1), 5 (2013).
  28. Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. J Vis Exp. (85), (2014).
  29. Kroon, J., Daniel, A. E., Hoogenboezem, M., van Buul, J. D. Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow. J Vis Exp. (90), e51766 (2014).
  30. Rahim, S., Üren, A. A real-time electrical impedance based technique to measure invasion of endothelial cell monolayer by cancer cells. J Vis Exp. (50), (2011).
  31. Galla, H. J., Thanabalasundaram, G., Wedel-Parlow, M., Rempe, R. G., Kramer, S., El-Gindi, J., Schäfer, M. A. B. The Blood-Brain-Barrier in Vitro: Regulation, Maintenance and Quantification of the Barrier Properties by Impedance Spectroscopy. Horizons in Neuroscience Research. , (2011).
  32. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
  33. Holman, D. W., Klein, R. S., Ransohoff, R. M. The Blood-Brain Barrier, Chemokines and Multiple Sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 220-230 (2011).
  34. Larochelle, C., Alvarez, J. I., Prat, A. How do immune cells overcome the blood-brain barrier in multiple sclerosis. FEBS Lett. 585 (23), 3770-3780 (2011).
  35. Choi, J., Enis, D. R., Koh, K. P., Shiao, S. L., Pober, J. S. T Lymphocyte-Endothelial Cell Interactions. Annu Rev Immunol. 22 (1), 683-709 (2004).
  36. Lyck, R., Engelhardt, B. Going Against the Tide – How Encephalitogenic T Cells Breach the Blood-Brain Barrier. J Vasc Res. 49 (6), 497-509 (2012).
  37. Engelhardt, B. Molecular mechanisms involved in T cell migration across the blood-brain barrier. J Neural Transm (Vienna). 113 (4), 477-485 (2006).
  38. von Wedel-Parlow, M., Schrot, S., Lemmen, J., Treeratanapiboon, L., Wegener, J., Galla, H. -. J. Neutrophils cross the BBB primarily on transcellular pathways: An in vitro study. Brain Res. 1367, 62-76 (2011).
  39. Perrière, N., Demeuse, P. H., et al. Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties. J Neurochem. 93 (2), 279-289 (2005).
  40. Bendayan, R., Lee, G., Bendayan, M. Functional expression and localization of P-glycoprotein at the blood brain barrier. Microsc Res Tech. 57, 365-380 (2002).
  41. Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (1), 315-327 (2011).
  42. Malina, K. C. K., Cooper, I., Teichberg, V. I. Closing the gap between the in-vivo and in-vitro blood-brain barrier tightness. Brain Res. 1284, 12-21 (2009).
  43. Ruck, T., Bittner, S., Meuth, S. Blood-brain barrier modeling: challenges and perspectives. Neural Regen Res. 10 (6), 889 (2015).
  44. Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. -. J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Res. 1053, 162-174 (2005).
  45. Schrot, S., Weidenfeller, C., Schäffer, T. E., Robenek, H., Galla, H. -. J. Influence of hydrocortisone on the mechanical properties of the cerebral endothelium in vitro. Biophys J. 89 (6), 3904-3910 (2005).
  46. Seebach, J., Dieterich, P., et al. Endothelial barrier function under laminar fluid shear stress. Lab Invest. 80 (12), 1819-1831 (2000).
  47. Siddharthan, V., Kim, Y. V., Liu, S., Kim, K. S. Human astrocytes/astrocyte-conditioned medium and shear stress enhance the barrier properties of human brain microvascular endothelial cells. Brain Res. 1147, 39-50 (2007).
  48. Santaguida, S., Janigro, D., Hossain, M., Oby, E., Rapp, E., Cucullo, L. Side by side comparison between dynamic versus static models of blood-brain barrier in vitro: a permeability study. Brain Res. 1109 (1), 1-13 (2006).
  49. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (µBBB). Lab Chip. 12 (10), 1784 (2012).
  50. Griep, L. M., Wolbers, F., et al. BBB ON CHIP: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomed Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).

Play Video

Cite This Article
Kuzmanov, I., Herrmann, A. M., Galla, H., Meuth, S. G., Wiendl, H., Klotz, L. An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction. J. Vis. Exp. (118), e54592, doi:10.3791/54592 (2016).

View Video