האינטראקציה בין ערוצי HCN ו למקטע העזר שלהם זוהה כיעד טיפולי הפרעת דיכאון מג'ורית. כאן, שיטת קרינה מבוססת קיטוב לזיהוי מעכבי מולקולה קטנים של אינטראקציה בין חלבונים זה, מוצגת.
ערוצי נוקלאוטיד-מגודר מחזוריים מופעל hyperpolarization (HCN) באים לידי ביטוי בכל מקום בגוף בכל רחבי המוח, שם הם מתפקדים להסדיר את הרגישות של נוירונים. חלוקת subcellular של הערוצים הללו עצב פירמידליים של האזור בהיפוקמפוס CA1 מוסדרת tetratricopeptide חלבון אינטראקציה חוזר המכיל Rab8b (TRIP8b), גידול למקטע עזר. נוקאאוט גנטי של HCN נקבובית להרכיב יחידות משנה או TRIP8b, הוא להוביל לעלייה בהתנהגות נגד דיכאון דמוי, דבר המצביע כי הגבלת הפונקציה של ערוצי HCN עשויה להיות שימושית כטיפול בהפרעת דיכאון מג'ורית (MDD). למרות עניין טיפולי משמעותי, ערוצי HCN באים לידי ביטוי גם בלב, שם הם מווסתים מקצב. כדי לעקוף בעיות מחוץ יעד הקשורים חסימת ערוצי HCN לב, במעבדה שלנו הציעה לאחרונה מיקוד האינטראקציה בין החלבונים בין HCN ו TRIP8b כדי להפריע לפעילות של ערוץ HCN במיוחד במוח.TRIP8b נקשר נקבובי HCN להרכיב יחידות משנה בשני אתרי אינטראקציה מובהקים, אף כאן הדגש הוא על האינטראקציה בין חוזרות tetratricopeptide (TPR) תחומים של TRIP8b ואת זנב C המסוף של HCN1. בפרוטוקול זה, תיאור מורחב של שיטה לטיהור TRIP8b וביצוע מסך תפוקה גבוהה לזהות מעכבי מולקולה קטנה של האינטראקציה בין HCN ו TRIP8b, מתואר. השיטה לסינון תפוקה גבוהה מנצלת קיטוב קרינה (FP) מבוסס assay לפקח על כריכה של שבר TRIP8b גדול על אחת עשר-tagged fluorophore אמינו פפטיד החומצה מתאים זנב מסוף HCN1 C. שיטה זו מאפשרת 'מכה' תרכובות כדי לזהות המבוססת על שינוי הקיטוב של האור הנפלט. מבחני אימות מבוצעים ואז לבטח 'מכה' תרכובות אינן artifactual.
ערוצי נוקלאוטיד-מגודר מחזוריים מופעל hyperpolarization (HCN) באים לידי ביטוי על הלב ועל מערכת עצבים מרכזית, שם הם ממלאים תפקיד חשוב בויסות קרום רגישות 1. ערוצי HCN היו מעורבים בפתוגנזה של הפרעת דיכאון מג'ורי (MDD) 2, אשר הובילה מספר קבוצות להציע כי הגבלת פרמקולוגית פונקצית ערוץ HCN עשויה להיות יעילה כמו טיפול חדשני MDD 3. עם זאת, מיקוד HCN ערוצים ישירות אינו בת קיימא בגלל התפקיד החשוב שלהם פוטנציאל הפעולה של לב 4. Ivabradine, ה- FDA אישר רק אנטגוניסט ערוץ HCN, משמש לטיפול באי ספיקת לב לייצר אפקט bradycardic 5. ככזה, יש צורך הסוכנים תרופתיים המגבילים פונקצית ערוץ HCN בלעדי במערכת העצבים המרכזית.
Tetratricopeptide לחזור המכילים חלבון אינטראקציה Rab8b (TRIP8b) הוא ספציפי במוחFIC למקטע עזר של ערוצי HCN שולט ביטוי המשטח והלוקליזציה של ערוצי HCN 6,7. נוקאאוט גנטי של TRIP8b גורמת לירידה של ערוצי המוח HCN 7 מבלי להשפיע ביטוי HCN בלב 8. מעניין, עכברים בנוקאאוט TRIP8b להשקיע פחות נייחי זמן על משימת לשחות בכפיית השעית זנב המשימה 7, שתי בדיקות סינון נפוצות עבור יעילות נגד דיכאון 9-11. תוצאות אלו מצביעות כי במקום ישירות מיקוד ערוצי HCN עם אנטגוניסט מולקולה קטן של פונקצית ערוץ HCN, לשבש את יחסי הגומלין בין TRIP8b ו HCN עשוי להיות מספיק כדי לייצר התנהגות נוגדת דיכאון דמוי.
TRIP8b נקשר HCN בשני אתרים מחייב ברורים. תחום המחייב המחזורי נוקלאוטיד (CNBD) של HCN אינטראקציה עם תחום שימור של מסוף TRIP8b ממוקם N אל תחומי TPR של 12,13 TRIP8b. למרות השאריות של CNBD כי הם מעורבים זהאינטראקציה מופתה 14, באזור של TRIP8b כי הוא מעורב לא הצטמצם מעבר AN-80-אמינו שבר חומצה 13. אינטראקציה שנייה מתרחשת בין חוזרות tetratricopeptide (TPR) התחומים של TRIP8b ואת tripeptide מסוף C של HCN ( "SNL" ב HCN1, HCN2, ו HCN4, אבל 'ANM' ב HCN3) 3,12. המבנה הגבישי נפתר לאחרונה 15 אינטראקצית זנב C זה חשף דמיון מבני מהותי באינטראקציה בין הקולטן יבוא peroxisomal, peroxin 5 (PEX5), ועל אינטראקצית שותפים, המכילה סוג 1 רצפי מיקוד peroxisomal (PTS1) 16.
למרות ששני אתרי האינטראקציה נדרשים לתפקוד ערוץ HCN, האינטראקציה בין תחומי TPR של TRIP8b ואת tripeptide מסוף C של HCN1 משמשת אתר הקישור הדומיננטי מסדיר ביטוי משטח HCN. לכן, אינטראקציה זו נבחרה כאתר המיקוד במחקר זה.במשך שארית של כתב היד, כאשר הפניה נעשית כדי האינטראקציה בין TRIP8b ו HCN, זה אינטראקציה זו שאליה מתייחס אליהם. אינטראקציה זו הוא סכם מרסיס מסיס מאוד של TRIP8b המתאים מסוף C המשומר שלה המכיל את תחומי TPR הנדרשים מחייב זנב C המסוף של HCN (שאריות 241-602 של 1a-4 isoforms של TRIP8b) 3.
על מנת לפתח מסך תפוקה גבוה לזהות מולקולות קטנות מסוגלות לשבש את האינטראקציה הזאת, קיטוב קרינה (FP) מבוסס assay הועסק 17. קיטוב הקרינה מבוסס על עירור של ליגנד מתויג fluorophore עם אור מקוטב, ומדידת מידת הקיטוב של הקרינה הנפלטת 18. בנוכחות שותף מחייב, התנועה הסיבובית של ליגנד הניאון מוגבלת ואור מקוטב נפלט 19. בהיעדר שותף מחייב, tהוא תנועה סיבובית של ליגנד מוביל פליטת אור depolarized.
בפרוטוקול המצורף, שיטה לטיהור מתויג מסוף N (6xHis) TRIP8b (241-602) באמצעות חומצה ניקל-nitrilotriacetic (Ni-נ.ת.ע) חרוזים מוצג. פרוטוקול דומה הועסק לטהר את גלוטתיון-S-transferase (GST) -tagged C מסוף 40 חומצות אמינו של HCN1 (C40 HCN1) המשמש בשלב 7 של הפרוטוקול. משיקולי שטח, תיאור מפורט של ההליך שהושמט.
בשנת צעדים 2 עד 7 של הפרוטוקול, עבודת הקרנת תפוקה גבוהה מוצגת (ראה איור 1). אינטראקציות בין חלבונים הן מטרה קשה לשמצה לסינון תפוקה גבוהה וקוראים מומלצים לחפש משאבים נוספים בנושא 20.
שלבי 2 ו -3 לפקודת הפרוצדורה לאפיין את הזיקה במבחנה של TRIP8b המטוהר (241-602) לבנות FOra isothiocyanate והעמסת (FITC) -tagged עשרה פפטיד החומצות האמיניות המתאים הזנב מסוף C של HCN1 (HCN1 FITC). בהתבסס על המבנה הגבישי של TRIP8b-HCN 15 מורכבות, רצף חומצות האמינו עשר זה מספיק כדי לייצר מחייב עם TRIP8b (241-602). בשלב 2, ד K של האינטראקציה נמדדת על ידי titrating TRIP8b (241-602) לתוך ריכוז קבוע של HCN1 FITC. בשלב 3, גרסה ללא תווית של הפפטיד HCN בשימוש בשלב 2 הוא טיטרציה לתוך ריכוז קבוע של שני TRIP8b (241-602) ו HCN1 FITC לבחון אם תג FITC מפריע מחייב. ניסויים אלה חיוניים בחירת הריכוזים המתאימים של TRIP8b (241-602) ו HCN1 FITC המשמשים במסך קצב העברת נתונים הגבוה.
נחת היסוד של מסך התפוקה הגבוהה היא מולקולה קטנה מסוגלת לשבש את יחסי הגומלין בין TRIP8b (241-602) ו HCN1 FITC יפיק דצמברrease לאור מקוטב. בשלב 4, הגורם Z של assay מחושב 21 עבור ריכוז נתון של TRIP8b (241-602) ו HCN1 FITC כדי להבטיח כי assay מתאים להקרנה תפוקה גבוהה (שלב 5). שלבי 6 ו -7 הם מבחני אימות כדי לאשר כי הנפילות במסך התפוקה הגבוהה העיקרי פועלות ע"י שיבוש האינטראקציה בין TRIP8b (241-602) ו HCN1 FITC ולא באמצעות מנגנון ספציפי. בשלב 6, carboxytetramethylrhodamine (טמרה) -labeled HCN1 פפטיד (HCN1 טמרה) משמש ב assay קיטוב הקרינה זהה אחרת לסנן תרכובות פלורסנט שמסכנת את assay FP שימוש בתג FITC. שלב 7 מנצל שבר מסוף HCN1 C גדול (HCN1 C40) ומעסיק assay קרב מבוסס חרוז, אשר מבוססת על "מינהור" של חמצן גופייה מן חרוז תורמות חרוז acceptor הביא קרובים אחד לשני על ידי אינטראקצית חלבונים 22.
בגלל הפוטנציאל שלה כיעד טיפולי ב MDD 24, חלה התעניינות רבה בגישות תרופתיות כי להרגיז פונקצית ערוץ HCN במערכת העצבים המרכזית 4. עם זאת, מאמצים אלה היו עוכבו על ידי התפקיד החשוב של ערוצי HCN ב pacemaking לב ואת הסיכון של הפרעות קצב 25. סברנו כי לשבש את יחסי הגומלין ב…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by National Institutes of Health Grant R21MH104471 and R01MH106511 (D.M.C.), Brain Research Foundation SG 2012-01 (D.M.C.), Northwestern University Clinical and Translational Sciences Institute 8UL1TR000150 (Y.H.), Chicago Biomedical Consortium HTS-004 (Y.H. and D.M.C.), and National Institutes of Health Grant 2T32MH067564 (K.L.). A part of this work was performed by the Northwestern University Medicinal and Synthetic Chemistry Core (ChemCore) at the Center for Molecular Innovation and Drug Discovery (CMIDD), which is funded by the Chicago Biomedical Consortium with support from the Searle Funds at the Chicago Community Trust and Cancer Center Support Grant P30 CA060553 from the National Cancer Institute awarded to the Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center. The high throughput screen work was performed in the High Throughput Analysis Laboratory which is also a core facility of the Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center.
Ni-NTA agarose | Qiagen | 30210 | |
Dialysis cassette | ThermoFisher | 66456 | |
Isopropyl b-D-1-thiogalactopyranoside | Sigma-Aldrich | I5502-1G | |
384 Well Black plate | Corning | 3820 | |
Proxiplate | Perkin-Elmer | 6008289 | |
Anti-GST Acceptor beads | Perkin-Elmer | 6760603C | |
NiChelate | Perkin-Elmer | AS101D | |
pGS21-a | Genscript | SD0121 | |
PMSF | Sigma-Aldrich | 10837091001 | |
Coomassie Kit | ThermoFisher | 23200 | |
Protein concentrator | ThermoFisher | 88527 | |
Perkin Elmer Enspire Multimode Plate reader | Perkin-Elmer | #2300-001M | |
BL21 (DE3) Competent Cells | Agilent | 200131 |