Summary

以下のための大腿骨のウィンドウチャンバーモデル<em>インビボ</emマウス骨髄内>細胞トラッキング

Published: July 28, 2016
doi:

Summary

The protocol describes a novel murine femur window chamber model that can be used to track movement of cells in the femoral bone marrow in vivo. Intravital multiphoton fluorescence microscopy is used to image three components of the femoral bone marrow (vasculature, collagen matrix, and neutrophils) over time.

Abstract

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, including hematopoiesis, immune regulation and tumor regulation. Commonly used methods for understanding cellular actions in the bone marrow, such as histology and blood counts, provide static information rather than capturing the dynamic action of multiple cellular components in vivo. To complement the standard methods, a window chamber (WC)-based model was developed to enable serial in vivo imaging of cells and structures in the murine bone marrow. This protocol describes a surgical procedure for installing the WC in the femur, in order to facilitate long-term optical access to the femoral bone marrow. In particular, to demonstrate its experimental utility, this WC approach was used to image and track neutrophils within the vascular network of the femur, thereby providing a novel method to visualize and quantify immune cell trafficking and regulation in the bone marrow. This method can be applied to study various biological processes in the murine bone marrow, such as hematopoiesis, stem cell transplantation, and immune responses in pathological conditions, including cancer.

Introduction

骨髄は造血及び免疫調節に関与する重要な器官です。これは、造血幹細胞および前駆細胞(HSPCs)を含む造血成分、および間葉細胞1を生じる非造血前駆細胞を含む間質成分から成ります。造血活性の三分の二は、骨髄細胞2の世代に捧げられています。 1-2×10 11細胞は、正常な成人2日ごとに生成して、特に、好中球の大多数は、骨髄で産生されます。好中球は、微生物感染に対する防御の第一線であり、ストレスが末梢 ​​好中球1,3を補完するために彼らの動員をトリガするまで、主に骨髄に予約されています。それらの抗菌効果に加えて、最近の研究では、形質転換成長によってプロ及び抗腫瘍形成表現型の両方を有する、癌生物学における好中球の重要な役割を示唆しています腫瘍微小環境4,5におけるシグナル伝達因子β(TGF-β)。また、研究では、循環中の好中球は、細胞毒性、抗転移効果8を発揮しながら、原発腫瘍に蓄積する好中球は、T細胞6,7の細胞傷害性機能を抑制することにより、プロ腫瘍形成および転移性効果を発揮することを実証しました。このように、骨髄中の造血細胞の研究、特に好中球は、免疫および腫瘍調節におけるそれらの役割を解明するために重要です。

組織病 ​​理学および完全な末梢血球数を日常骨髄9細胞および構造変化を評価するために使用されます。しかしながら、これらの方法は、異なる細胞集団または組織の微細構造の静的な情報を提供します。長手方向のインビボイメージングは、複数の細胞、血管および間質成分の動力学ならびに細胞からCを評価するための標準的な方法と組み合わせて使用することができます縦の方法でエル相互作用。顕微鏡の分解能10で生きている動物の画像化として定義される生体顕微鏡(IVM)は、必要な実験動物の数を減少させる、同じ試料中の経時動的な細胞プロセスを評価するために特に有用です。 IVMは、多くの場合、数週間から数ヶ月の期間にわたって画像化の対象の臓器にアクセスするために慢性的に移植窓室(WC)と組み合わされます。頭蓋と背皮脂WCのモデルが戻って1990年代半ばにさかのぼる使用の最も長い歴史を持っています。より最近では、このような乳房脂肪パッドおよび様々な腹部の器官のものなどの他の臓器特異的WCモデル11を開発されてきました。

生体内で骨髄を撮像するための典型的なアプローチは、薄くなった骨が最小限の外科的介入12-14と単一細胞の直接可視化を可能にしたマウスの頭蓋冠、の主に関与露出を持っています。しかし、頭蓋冠の骨髄は、bの場合があり電子HSPCs 15の維持・発展を減少示し頭蓋冠でHSPCsと低酸素細胞の低い数、によって示されるように、そのような長い骨のような他の骨、のとは異なります。したがって、長骨内の細胞成分を評価するための代替的なアプローチが研究されてきました。これらは、大腿骨の髄16と背側皮下脂肪WC 17で分割大腿骨の異所性移植の直接のエクスポージャーが含まれます。しかし、前者はより長い期間にわたって、セルラー構造的および機能的変化の追跡を許可しない端末の手順であり、後者の可能性が高いが原因背側皮下脂肪WC内部の異所性サイトへの大腿骨の移植に正常な骨髄機能を妨げます。時間をかけて大腿骨髄の同所シリアルイメージングを可能にするもう一つの方法は、大腿骨にWCを使用することです。一つ前のレポートでは、使用して大腿骨髄中の微小循環の長期的なイメージングを実証しましたマウス18で大腿骨WC。さらに、著者らは、骨髄転移をモニタリングにおけるその有用性を示す、大腿骨における腫瘍細胞の可視化を示しました。しかし、このWCの設計は、それによって作り、その大きなサイズ(1.2センチ直径)と大規模なマウスのみに適した比較的小さな撮影領域(直径4mm)、(26〜34グラム、生後3-6ヶ月)によって制限されていました日常的な使用のための非現実的なアプローチ。

したがって、小さい全体のサイズと大きい内側の撮像領域を持つ新しいWCは、本研究の目的のために設計されました。この研究の目的は、大腿骨の髄内に種々の細胞型を撮像するための方法を提供することでした。大腿骨WCモデルは、社内で開発された3D血管網内の好中球を可視化し、追跡するために使用されました。このモデルを用いて、骨髄のIVMは、40日間に渡って連続的に行うことができます。このアプローチは、免疫調節A、造血のプロセスを解明するための様々な分野に適用することができますND腫瘍発生。

Protocol

注:すべての動物の作業は、大学健康ネットワーク施設内動物管理使用委員会によって承認されたプロトコルの#2615で行いました。 マウスの1外科の準備手術に先立ち、オートクレーブにより、すべての手術器具や窓室(WC)を滅菌します。 2日前、手術とアモキシシリンの50 mg / kg体重で飲料水を補います。腹腔内に4時間、手術前にブプレノルフィンの0.1 mg / kg体重でマウスを注…

Representative Results

マウス大腿骨髄が正常に個々の好中球および血管ネットワークの可視化を可能にするためにWCを使用してアクセスします。1は、WCの楽器を示し、内部の光学アクセスを得るために、大腿骨と皮質骨の菲薄化の露出を伴う外科手術を、説明図骨。手術はマウスで忍容性が良好です。それらは苦痛の無い報告書では、このような5日後に手術のため…

Discussion

リアルタイムは、骨髄中の動的な細胞プロセスの連続撮影は、そうでなければ、このような組織学および総血球数などの従来の技術を用いて得ることが挑戦されている情報を提供します。ここで説明した大腿骨WCモデルは、時間の経過とともに、骨髄中の細胞と構造変化を調査するためのユニークな機会を提供しています。大腿骨WCモデルは、以前に報告されているが、本発明の新規な設計は…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、WCと撮影台を製造するためのプリンセスマーガレットがんセンターマシンショップから顕微鏡の支援のために大学健康ネットワークで高度な光学顕微鏡施設(www.aomf.caを)感謝したい、と氏はジェイソン・エリスでしょう。また、原稿編集のために博士アイリスKulbatskiに感謝したいと思います。

Materials

NRCNU-F athymic nude mice Taconic Ncr nude 8-10 weeks old, female
Saline Baxter JB1302P
Ketamine hydrochloride Bioniche Animal Health Canada, Inc.  DIN 01989529
Xylazine Bayer HealthCare, Bayer Inc. DIN 02169592
Surgical drape Proxima DYNJP2405
Electric heating pad Life Brand 57800827375
Stereomicroscope Leica Leica M60
Eye ointment (tear gel) Novartis  T296/2
7.5% betadine Purdue Frederick Co 67618-151-16
70% isopropyl alcohol GreenField P010IP7P
10% betadine Purdue Frederick Co 67618-150-05
Scalpel handle (#3) Fine Science Tools 10003-12
Scalpel blade (#15) VWR 89176-368
Spring Scissors curved Fine science Tools 15023-10
Baby-Mixter Hemostat Fine science Tools 13013-14
Fine Scissors Fine science Tools 14094-11
Extra Fine Graefe Forceps Fine science Tools 11151-10
Halsted-Mosquito Hemostats Fine science Tools 13008-12
Micro-drill Harvard Apparaus 72-6065
Micro-drill burrs Fine Science Tools 19007-14
Femur window chamber PMCC machine shop custom design 9.1mm- 8.5mm- 7.5 mm (outer to inner diameter), 2.16 mm (radius of two holes), 13.9mm (distance between two holes), 0.7mm (thickness)
U-shaped bar PMCC machine shop custom design 13.8mm (length), 1.6 mm (width), 3.7mm (height)
Coverglass (8mm) Warner Instruments  HBIO 64-0701 CS-8R
Retaining ring (8mm) ACKLANDS GRAINGER UNSPSC # 31163202
Nuts (hexagon stainless steel) Fastenal 70701
Dental cement 3M RelyX U200
Suture (5-0 Monosof black) Covioien SN-5698
Halsey needle holder Fine Science Tools 12501-13
Buprenorphine (Temgesic) Reckitt Benckiser DIN 0281251
Meloxicam (Metacam) Boehringer Ingelheim DIN 02240463
Amoxicillin (Clamavox) Pfizer DIN 02027879
FITC-Dextran Sigma-Aldrich FD2000S
APC- Anti-Mouse Ly-6G (Gr-1)  eBioscience 17-9668
Two-photon microscope LSM 710 Carl Zeiss Zeiss LSM 710 NLO
Imaging stage PMCC machine shop custom design 15.9cm (length), 11cm (width), 0,9cm (height)
Imaris software Bitplane Imaris 8.0 Image analysis software described in Section 3 of the Protocol 
Zen 2012 Zeiss Zen 2012 Image acqusition software described in Section 2 of the Protocol 

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Cite This Article
Chen, Y., Maeda, A., Bu, J., DaCosta, R. Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow. J. Vis. Exp. (113), e54205, doi:10.3791/54205 (2016).

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