An example of adenoviral gene therapy in the human diabetic organ-cultured corneas is presented towards the normalization of delayed wound healing and markedly reduced epithelial stem cell marker expression in these corneas. It also describes the optimization of this process in stem cell-enriched limbal epithelial cultures.
Цель этого протокола заключается в описании молекулярных изменений в диабетических роговиц человека и показать, как они могут быть облегчены с помощью аденовирусной генной терапии в органе культивируют роговиц. Диабетическая заболевания роговицы является осложнение диабета с частыми аномалиями нервов роговицы и эпителиальной заживления раны. Мы также зарегистрировали значительно измененную экспрессию нескольких предполагаемых маркеров эпителиальных стволовых клеток при диабете роговиц человека. Чтобы облегчить эти изменения, аденовирусной генной терапии была успешно осуществлена с использованием повышающую регуляцию с-встретил протоонкогена экспрессии и / или понижающей регуляции протеиназы матрицы металлопротеиназы-10 (ММР-10) и катепсина F. Эта терапия ускоренного заживления ран у больных сахарным диабетом роговиц даже тогда, когда только лимбальных стволовых клеток отсек трансдуцированная. Наилучшие результаты были получены при комбинированном лечении. Для возможной трансплантации пациентов нормированных стволовых клеток, пример также представлен в ОПТИМИЗАЦИЯна трансдукции гена в клеточных культурах, обогащенной стволовыми использованием поликатионные усилителями. Такой подход может быть полезен не только для выбранных генов, но и для других медиаторов эпителия роговицы заживления ран и стволовых клеток функцию.
Диабетическая заболевания роговицы в основном приводит к дегенеративным эпителиальные (кератопатии) и нервов (невропатия) изменений. Она часто проявляется аномалии эпителиального заживления ран и уменьшения рогового нерва 1-4. По оценкам , 60-70% больных диабетом имеют различные проблемы роговицы 1,3. Проведенные нами исследования выявили несколько белков – маркеров с измененной экспрессии в диабетических роговиц человека , включая понижающей с-мет прото-онкогенов (рецептор фактора роста гепатоцитов) и повышающей регуляцией матриксных металлопротеиназ-10 (ММР-10) и катепсина F 5, 6. Мы также зафиксировали значительное снижение экспрессии нескольких предполагаемых маркеров эпителиальных стволовых клеток в диабетической роговиц человека.
В предыдущих исследованиях мы разработали на основе аденовирусов генной терапии для нормализации уровней маркеров диабета изменены с помощью диабетической роговице системы органной культуры человека, которая показывает медленное заживление ран, диабетическуюИзменения маркера, и стволовых снижение экспрессии клеточного маркера , похожий на роговицу бывших естественных условиях 7,8. Это сохранение изменений , как представляется, из – за существования эпигенетической памяти метаболического 9. Эта система культуры использовали далее для генной терапии. Цели для этой терапии были выбраны из маркеров либо с пониженной экспрессией в диабетических роговиц (с-мет протоонкогена), или повышенная экспрессия (MMP-10 и катепсин F).
Аденовирусная (AV) терапия была использована в целом органных культивируют роговиц или корнеосклеральный периферической лимбальных только купе. Это отделение таит эпителиальные стволовые клетки , которые возобновить эпителий роговицы и активно участвовать в ранозаживляющих 4,10-15. Здесь протоколы предназначены для нормальной и диабетического человека роговичного органной культуры, эпителиальные заживление ран, выделение и характеристики клеток, обогащенных культур стволовых клеток лимбальных и аденовирусной трансдукции клетки и роговичного. нашРезультаты показывают целесообразность этой терапии для нормализации экспрессии маркеров и заживление ран у больных сахарным диабетом роговиц для возможной трансплантации в будущем. Они также предполагают , что комбинированная терапия является наиболее эффективным способом восстановить нормальную структуру маркера и эпителиальной исцеление в диабетической роговицы 16-18.
Роговица, как представляется, является идеальным ткани для генной терапии из-за своей поверхности места, где для доставки генов, а также оценка эффективности и побочных эффектов, которые легко. Тем не менее, клинический перевод этого мощного подхода по – прежнему медленно из – за недоста…
The authors have nothing to disclose.
We gratefully acknowledge financial support by NIH/NEI R01 EY13431 (AVL), CTSI grant UL 1RR033176 (AVL), and grants from the Regenerative Medicine Institute, Cedars-Cedars Medical Center.
minimum essential medium | Thermo Fisher Scientific | 11095-080 | |
Optisol-GS | Bausch & Lomb | 50006-OPT | |
ABAM antibiotic-antimycotic mixture | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
calf skin collagen | Sigma-Aldrich | C9791 | |
agar, tissue culture grade | Sigma-Aldrich | A1296 | |
n-heptanol | Sigma-Aldrich | 72954-5ML-F | |
O.C.T. compound | VWR International | 25608-930 | |
Dispase II | Roche Applied Science | 4942078001 | |
keratinocyte serum-free medium (KSFM) | Thermo Fisher Scientific | 17005042 | |
EpiLife medium with calcium | Thermo Fisher Scientific | MEPI500CA | |
N2 medium supplement, 100x | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
B27 medium supplement, 50x | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
human keratinocyte growth supplement, 100x | Thermo Fisher Scientific | S-001-5 | |
trypsin 0.25% – EDTA 0.02% with phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
trypsin 0.25% with phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15050065 | |
soybean trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T6414 | |
fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
insulin-transferrin-selenite supplement (ITS) | Sigma-Aldrich | I3146-5ML | |
antibody to keratin 14 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53253 | |
antibody to keratin 15 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47697 | |
antibody to keratin 17 | Santa Cruz Biotechnology | SC-58726 | |
antibody to ΔNp63α | Santa Cruz Biotechnology | sc-8609 | |
antibody to PAX6 | BioLegend | PRB-278P-100 | |
antibody to nidogen-1 | R&D Systems | MAB2570 | |
antibody to integrin α3β1 | EMD Millipore | MAB1992 | |
human fibronectin | BD Biosciences | 354008 | |
human laminin | Sigma-Aldrich | L4445 | |
human type IV collagen | Sigma-Aldrich | C6745-1ML | |
adenovirus expressing MMP-10 shRNA | Capital BioSciences | custom made | |
adenovirus expressing cathepsin F shRNA | Capital BioSciences | custom made | |
adenovirus expressing scrambled shRNA and GFP | Capital BioSciences | custom made | |
adenovirus expressing c-met | OriGene (plasmid) | SC323278 | |
adenovirus expressing GFP | KeraFAST | FVQ002 | |
sildenafil citrate, 25 mg | Pfizer | from pharmacy | |
epidermal growth factor | Thermo Fisher Scientific | PHG0311 | |
poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
polybrene | Sigma-Aldrich | 107689-10G | |
ViraDuctin | Cell Biolabs | AD-200 | |
ibiBoost | ibidi, Germany | 50301 | |
phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | |
Corning round end spatula | Dow Corning | 3005 | |
60-mm petri dishes | Thermo Fisher Scientific | 174888 | |
Nunc Lab-Tek II multiwell chamber slides | Sigma-Aldrich | C6807 | |
200 microliter pipet tips | Bioexpress | P-1233-200 | other suppliers available |
inverted microscope | Nikon | Diaphot | other suppliers/models available |
humidified CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 370 (Steri-Cycle) | other suppliers/models available |
fluorescent microscope | Olympus, Japan | BX-40 | other suppliers/models available |
dissecting stereo microscope | Leica, Germany | S4 E | other suppliers/models available |