Summary

Derivazione senza alimentatore di melanociti da cellule staminali umane pluripotenti

Published: March 03, 2016
doi:

Summary

Questo lavoro descrive un protocollo in vitro la differenziazione di produrre pigmentate, i melanociti maturi da cellule staminali pluripotenti umane tramite una cresta neurale e melanoblast fase intermedia utilizzando un protocollo senza alimentatore 25 giorni.

Abstract

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can direct the differentiation of hPSCs into the cell type of interest by manipulating the culture conditions to recapitulate signals seen during development. One such cell type is the melanocyte, a pigment-producing cell of neural crest (NC) origin responsible for protecting the skin against UV irradiation. This protocol presents an extension of a currently available in vitro Neural Crest differentiation protocol from hPSCs to further differentiate NC into fully pigmented melanocytes. Melanocyte precursors can be enriched from the Neural Crest protocol via a timed exposure to activators of WNT, BMP, and EDN3 signaling under dual-SMAD-inhibition conditions. The resultant melanocyte precursors are then purified and matured into fully pigmented melanocytes by culture in a selective medium. The resultant melanocytes are fully pigmented and stain appropriately for proteins characteristic of mature melanocytes.

Introduction

Le cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) forniscono una piattaforma per imitare la differenziazione normale in un modo scalabile per la modellazione della malattia, lo screening di stupefacenti, e le terapie di sostituzione cellulare 1-6. Di particolare interesse, hPSCs aprono strade per studiare difficili da isolare o tipi di cellule rare / transitori in cui i campioni dei pazienti sono scarse. Cellule staminali pluripotenti Inoltre, indotte (iPSCs) permettono ai ricercatori di studiare lo sviluppo e la modellazione della malattia in modo specifico paziente a svelare i meccanismi unici 1,2,7-11. Il protocollo precedentemente pubblicato per la differenziazione dei melanociti da hPSCs richiede fino a 6 settimane di differenziazioni e coinvolge le cellule di coltura con medium condizionato dalle cellule L-Wnt3a 12. Il protocollo prima presentata da Mica et al. E qui descritto produce cellule pigmentate in tre settimane e rimuove l'ambiguità e incoerenze associate a mezzo condizionato.

I melanociti are derivati ​​dalla cresta neurale, una popolazione di cellule migratoria unici per vertebrati. La cresta neurale è definita durante gastrulation e rappresenta una popolazione di cellule sul bordo della piastra neurale, al confine tra la ectoderma neurale e non neurale. Durante neurulazione, il tessuto nervoso evolve da una piastra neurale per formare pieghe neurali, che convergono sulla linea mediana dorsale, con conseguente 13,14 tubo neurale.

Le cellule della cresta neurale emergono dalla piastra tetto del tubo neurale, di fronte alla notocorda, e subiscono una transizione epitelio mesenchimale prima di migrare via per dare luogo ad una popolazione eterogenea di cellule differenziate. I destini delle cellule della cresta sono definite in parte dalla posizione anatomica della lamiera del tetto lungo l'asse del corpo dell'embrione. Derivati ​​di cellule della cresta neurale includono linee caratteristiche di entrambi mesoderma (cellule muscolari lisce, osteoblasti, adipociti, condrociti) e le cellule ectoderma (melanociti, Schwann cells, neuroni) 14. Le cellule staminali della cresta neurale upregulate il fattore di trascrizione SOX10 e possono essere isolate da cellule di fluorescenza-attivato l'ordinamento con anticorpi anti p75 e HNK1.

Le cellule della cresta neurale destinato a diventare melanociti passare attraverso una fase melanoblast e upregulate KIT e MITF (fattore di trascrizione microftalmia-associato) 6,21 MITF è un regolatore Master di Sviluppo melanociti ed è un fattore di trascrizione responsabile del controllo gran parte dello sviluppo melanociti 22- 24. melanoblasts umani migrano allo strato basale dell'epidermide dove risiedono sia nel ringrosso capelli o circondato da cheratinociti nell'epidermide (unità formanti pigmentazione) da utilizzare come precursori delle maturi, melanociti pigmentati. La differenziazione e la maturazione delle melanoblasts in melanociti pigmentati avviene in concomitanza con la colonizzazione del bulbo pilifero e l'espressione della filiera di produzione di melanina (TYRP1, TYR, OCA2 ePMEL) 25,26.

Isolare melanociti umani e melanoblasts da pazienti è costoso, difficile e limitante nella quantità. Questo protocollo consente ai ricercatori di differenziare hPSCs (indotta o embrionali) in melanociti o precursori melanociti in un metodo ben definito, rapida, riproducibile, scalabile ed economica, senza l'ordinamento delle cellule. Il protocollo è stato utilizzato in precedenza per identificare i difetti malattie specifiche quando differenziare iPSCs da pazienti con disturbi della pigmentazione.

Protocol

NOTA: Il protocollo di melanociti qui delineato è stato dimostrato da Mica et al. 1. Preparazione del terreno di coltura, patinata Piatti e manutenzione di hPSCs Media Preparazione Nota: Conservare tutto media a 4 ° C al buio fino a 2 settimane. Filtro di medie per la sterilizzazione. Preparare DMEM / 10% FBS. Mescolare 885 ml DMEM, 100 ml FBS, 10 ml Pen / Strep e 5 ml di L-glutammina. Filtro per la sterilizzazione. Preparare hESC-media. Mescolare 800 m…

Representative Results

Questo protocollo fornisce un metodo per derivare completamente pigmentate, melanociti adulte hPSCs in un alimentatore-libera, economicamente efficiente e riproducibile modo in vitro. In contrasto con il precedentemente stabilito Fang et al. Protocollo per melanociti HPSC-derivati, il protocollo descritto non richiede terreno condizionato e diminuisce il tempo richiesto. Il protocollo Fang et al. Utilizzato mezzo condizionato da una linea di cellule murine Wnt3…

Discussion

Per la differenziazione di successo dei melanociti da hPSCs i seguenti suggerimenti dovrebbero essere presi in considerazione. Innanzitutto, è essenziale lavorare in condizioni di coltura sterili in ogni momento. Inoltre, è importante iniziare con pluripotenti, hPSCs completamente indifferenziate; se la popolazione di partenza contiene cellule differenziate del rendimento invariabilmente cadere come gli agenti inquinanti non possono essere indirizzate verso i melanociti e può anche distruggere ulteriormente le celle …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di studio per i ricercatori di melanoma dal Joanna M. Nicolay Foundation e dal National Institutes of Health sotto Ruth L. Kirschstein Nazionale Premio Research Service F31. Questo lavoro è stato ulteriormente supportato attraverso sovvenzioni dal NYSTEM e l'iniziativa di cellule staminali Tri-istituzionale (Starr Foundation).

Materials

Accutase Innovative Cell Technologies AT104
apo human transferrin Sigma T1147
Ascorbic Acid (L-AA) Sigma A4034 100 mM
B27 (B27 Supplement) Invitrogen 17504044
β-Mercaptoethanol Gibco-Life Technologies 21985-023 10 mg/ml
BMP4 R&D Systems 314-bp
CHIR99021 Tocris-R&D Systems 4423 6 mM
Cholera toxin Sigma C8052 50 mg/ml
cAMP (cyclicAMP) Sigma D0627 100 mM
Dexamethasone Sigma D2915-100MG 50 μM
DMEM – Dulbecco's Modified Eagle Medium Gibco-Life Technologies 11985-092
DMEM/F12 – Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 Gibco-Life Technologies 1133–032
DMEM/F12 powder Invitrogen 12500-096
EDN3 (Endothelin-3, human) American Peptide Company 88-5-10B 100 μM
Fibronectin BD Biosciences 356008 200 μg/ml
gelatin (PBS without Mg/Ca) in house 0.1% in PBS
Glucose Sigma G7021
Human insulin Sigma I2643
ITS+ Universal Culture Supplement Premix  BD Biosciences 354352
KSR (Knockout Serum Replacement) Gibco-Life Technologies 10828-028
Knockout DMEM Gibco-Life Technologies 10829-018
L-Glutamine Gibco-Life Technologies 25030-081
LDN193189 Stemgent 04-0074 100 mM
Low glucose DMEM Invitrogen 11885-084
Matrigel matrix BD Biosciences 354234 Dissolve 1:20 in DMEM/F12
MCDB201 Medium Sigma M6770
MEM minimum essential amino acids solution Gibco-Life Technologies 11140-080
Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial) GlobalStem GSC-8105M
Mouse Laminin-I R&D Systems 3400-010-01 1 mg/ml
Neurobasal medium Invitrogen 21103049
Penicilin/Streptomycin Gibco-Life Technologies 15140-122 10,000 U/ml
Poly-L Omithin hydrobromide Sigma P3655 15 mg/ml 
Progesterone Sigma P8783 0.032g in 100ml 100% ethanol
Putrescine dihydrochloride Sigma P5780
FGF2 (Recombinant human FGF basic) R&D Systems 233-FB-001MG/CF 10 mg/ml
SB431542 Tocris-R&D Systems 1814 10 mM
Selenite Sigma S5261
Sodium Bicarbonate Sigma S5761
SCF (Stem Cell Factor, recombinant Human)  Peprotech Inc. 300-07 50 μg/ml
TYRP1 (G-17) Antibody Santa Cruz 10443 1:200
TYRP2 Antibody Abcam 74073 1:200
Trypsin-EDTA (0.05%) Gibco-Life Technologies 25300-054
Y-27632 dihydrochloride Tocris-R&D Systems 1254 10 mM

References

  1. Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
  2. Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
  3. Lee, G., et al. Large-scale screening using familial dysautonomia induced pluripotent stem cells identifies compounds that rescue IKBKAP expression. Nat biotechnol. 30, 1244-1248 (2012).
  4. Lee, G., Studer, L. Induced pluripotent stem cell technology for the study of human disease. Nat methods. 7, 25-27 (2010).
  5. Zimmer, B., et al. Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells. Environ health persp. 120, 1116-1122 (2012).
  6. Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs. Cell rep. 3, 1140-1152 (2013).
  7. Mariani, J., et al. FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders. Cell. 162, 375-390 (2015).
  8. Doulatov, S., et al. Modeling Diamond Blackfan Anemia in Vivo Using Human Induced Pluripotent Stem Cells. Blood. 124, (2014).
  9. Cherry, A. B. C., Daley, G. Q. Reprogrammed Cells for Disease Modeling and Regenerative Medicine. Annu Rev Med. 64, 277-290 (2013).
  10. Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. iPS cells: a game changer for future medicine. Embo J. 33, 409-417 (2014).
  11. Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494, 105-110 (2013).
  12. Fang, D., et al. Defining the conditions for the generation of melanocytes from human embryonic stem cells. Stem cells. 24, 1668-1677 (2006).
  13. Huang, X., Saint-Jeannet, J. P. Induction of the neural crest and the opportunities of life on the edge. Dev biol. 275, 1-11 (2004).
  14. White, R. M., Zon, L. I. Melanocytes in development, regeneration, and cancer. Cell stem cell. 3, 242-252 (2008).
  15. Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells. Cell. 96, 737-749 (1999).
  16. Elworthy, S., Pinto, J. P., Pettifer, A., Cancela, M. L., Kelsh, R. N. Phox2b function in the enteric nervous system is conserved in zebrafish and is sox10-dependent. Mech develop. 122, 659-669 (2005).
  17. Harris, M. L., Baxter, L. L., Loftus, S. K., Pavan, W. J. Sox proteins in melanocyte development and melanoma. Pigm cell melanoma r. 23, 496-513 (2010).
  18. Herbarth, B., et al. Mutation of the Sry-related Sox10 gene in Dominant megacolon, a mouse model for human Hirschsprung disease. PNAS. 95, 5161-5165 (1998).
  19. Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model. Nat genetics. 18, 60-64 (1998).
  20. Dupin, E., Glavieux, C., Vaigot, P., Le Douarin, N. M. Endothelin 3 induces the reversion of melanocytes to glia through a neural crest-derived glial-melanocytic progenitor. PNAS. 97, 7882-7887 (2000).
  21. Lister, J. A., Robertson, C. P., Lepage, T., Johnson, S. L., Raible, D. W. nacre encodes a zebrafish microphthalmia-related protein that regulates neural-crest-derived pigment cell fate. Development. 126, 3757-3767 (1999).
  22. Hou, L., Panthier, J. J., Arnheiter, H. Signaling and transcriptional regulation in the neural crest-derived melanocyte lineage: interactions between KIT and MITF. Development. 127, 5379-5389 (2000).
  23. Levy, C., Khaled, M., Fisher, D. E. MITF: master regulator of melanocyte development and melanoma oncogene. Trends mol med. 12, 406-414 (2006).
  24. Phung, B., Sun, J., Schepsky, A., Steingrimsson, E., Ronnstrand, L. C-KIT signaling depends on microphthalmia-associated transcription factor for effects on cell proliferation. PloS one. 6, e24064 (2011).
  25. Grichnik, J. M., et al. KIT expression reveals a population of precursor melanocytes in human skin. J invest dermatol. 106, 967-971 (1996).
  26. Li, L., et al. Human dermal stem cells differentiate into functional epidermal melanocytes. J cell sci. 123, 853-860 (2010).
  27. Nishimura, E. K., et al. Dominant role of the niche in melanocyte stem-cell fate determination. Nature. 416, 854-860 (2002).
  28. Zur Nieden, N. I. . Embryonic stem cell therapy for osteo-degenerative diseases : methods and protocols. , (2011).
  29. Lee, J. H., et al. high-content screening for novel pigmentation regulators using a keratinocyte/melanocyte co-culture system. Exp dermatol. 23, 125-129 (2014).

Play Video

Cite This Article
Callahan, S. J., Mica, Y., Studer, L. Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (109), e53806, doi:10.3791/53806 (2016).

View Video