NC-GELFrEE - Limpar nativo de gel eluída fracção líquida Entrapment Electroforese

A maioria dos processos biológicos que acontecem dentro de uma célula são pensados ​​para ser levada a cabo por conjuntos de proteínas, em vez de proteínas individuais ^1. Por conseguinte, a fim de elucidar o papel biológico específico de uma subunidade de proteína numa célula é necessário para entender as suas interacções com outras proteínas estruturais ou ligandos em complexos de ^2. No entanto, estudando proteínas nativamente, mantendo suas interações e atividade não-covalentes, continua sendo um desafio. Uma das deficiências dos estudos proteína nativa é uma técnica de separação nativa adequado que seja compatível com as várias técnicas de análise de proteína a jusante. Portanto, recente interesse em técnicas de separação, capazes de caracterizar os conjuntos não covalentes de biomoléculas aumentou acentuadamente ^3.

técnicas de separação de proteínas são fundamentais para bioquímica, biofísica e vários outros estudos. técnicas de separação nativos atuais têm intrinsideficiências c que reduzem a compatibilidade com análises a jusante, tais como baixa resolução, baixa taxa de transferência, perda de precipitação, bem como a exigência de grandes quantidades de amostra inicial. Tandem purificação por afinidade é normalmente utilizada para estudos de interacção proteína, mas tem que ser levada a cabo separadamente para cada proteína alvo, fazendo com que seja incompatível com a análise de alto rendimento ^4. Cromatografia de exclusão de tamanho ^5, precipitação seletiva com cromatografia de afinidade de iões de ⁵ e densidade de gradiente de separação ⁶ todos têm fornecido separações nativos, mas são inerentemente técnicas de baixa resolução e requerem grandes quantidades iniciais de amostras.

Alternativamente, técnicas baseadas em gel, tais como azul nativo (BN) e Clear PAGE nativo (CN) (ou 1-D ou 2-D), apresentar separação de alta resolução. Além disso, em contraste com outras técnicas mencionadas, ambas as separações página native manter a solubilidade e conformação nativa de um r largaange de espécies de macromoléculas, incluindo as proteínas hidrofóbicas. Esse recurso amplia ainda mais a cobertura proteoma alcançado por estes métodos ^7,8 e é conseguida através da química diferente entre CN e BN-PAGE. CN-PAGE comumente se baseia em detergentes suave cobrado como moléculas de transporte, substituindo o corante azul de Coomassie em BN-PAGE. BN-PAGE, embora associado com maior resolução, tem advertências, tais como redução da atividade enzimática nas proteínas separadas ⁸ e formação de aduto molécula de Coomassie, sendo este último muito prejudicial para MS jusante analisa ^9. Ambos os métodos, no entanto, são tradicionalmente associados com baixa recuperação e cobertura proteoma estreita devido à coloração e limitações de extração de gel ^7.

Para o estudo de proteínas desnaturadas, existem várias técnicas que manter a solubilidade macromolécula durante a execução de fraccionamento de alta resolução com elevada recuperação de proteína e que são compatíveis com diVerse técnicas de análise de proteína pós-separação. Gel que eluiu fracção líquida Armadilha de electroforese (GELFrEE) é uma das técnicas de fraccionamento que cabem todas estas características. Este método é amplamente aplicado em estudos de alto rendimento proteómica de cima para baixo, indicando que ele é rápido e versátil. Em GELFrEE, as proteínas são desnaturadas e separados com base no peso molecular por meio de uma matriz de gel tubular, a porosidade dos quais podem ser variadas com base em requisitos de amostra e os resultados desejados de fraccionamento. As fracções foram eluídas em fase líquida, reduzindo assim as limitações associadas com a recuperação de SDS-PAGE, mantendo alta resolução. Alíquotas fracção pode, então, ser analisado por um D-PAGE para-peso molecular selecção largura de banda ^11. Há uma alta demanda para as vantagens associadas GELFrEE em técnicas de separação nativas. O método aqui descrito, claro nativo GELFrEE (NC-GELFrEE), é uma adaptação nativa de GELFrEE. A fim de ser compatível com uma ampla spectrum de macromoléculas no seu estado nativo, este método baseia-se não só na química suave NC-PAGE, mas também em uma separação por gradiente de porosidade, o que reduz a precipitação de proteína, eliminando a transição entre a dura porosidades presentes em sistemas de gel descontínuos ^9. Quando aplicado a fraccionar complexos de proteínas extraídas a partir do coração de rato, fracções eluídas apresentado uma separação de alta resolução de uma ampla gama de pesos moleculares obtida foi elevada recuperação e. Além disso, as fracções resultantes são compatíveis com a maioria das análises bioquímicas e biofísicas da proteína a jusante.