CN-GELFrEE - 透明天然凝胶洗脱液体馏分偷天陷阱电泳
Summary
This protocol describes how to prepare and perform clear native gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis (CN-GELFrEE), a native separation technique for non-covalent biomolecular assemblies and proteins from heterogeneous samples that is compatible with various downstream protein analysis techniques.
Abstract
蛋白质复合物进行的关键细胞功能的阵列。阐明它们的非共价相互作用和动力学是非常重要的用于理解在生物系统中复合物的作用。而生物分子组件的直接表征近年来已变得日益重要，天然分级分离技术能与下游分析技术，包括质谱兼容，是必要的，以进一步扩展这些研究。然而，该领域缺乏高通量，宽范围，高回收率分离为天然蛋白质装配方法。这里，我们提出明确天然凝胶洗脱液体馏分包封电泳（CN-GELFrEE），这对于非共价蛋白组件的新颖的分离方式。 CN-GELFrEE分离性能是由来自小鼠心脏提取物分馏证明。级分收集在2小时和显示离散频带范围从〜30到500 kDa的。一个反面观察到提高分子量带宽sistent图案，各测距〜100 kDa的。此外，通过SDS-PAGE天然组分的随后再分析表明分子量转移与蛋白质复合物的变性一致。因此，CN-GELFrEE被证明提供从一个大分子量范围上的蛋白质复合物执行高分辨率和高恢复天然分离的能力，从而提供了与下游蛋白质分析兼容的级分。
Introduction
大多数生物过程的细胞内发生的被认为是由蛋白质组件而不是单一的蛋白质1进行。因此，为了阐明在细胞中的蛋白质亚基的特定的生物作用，有必要了解在配合物2其与其他蛋白或配体的结构的相互作用。然而，研究蛋白质本身，保持它们的非共价相互作用和活性，仍然具有挑战性。一种天然蛋白质研究的缺点是一个合适的原生的分离技术，可与各种下游蛋白质分析技术兼容。因此，最近在分离技术能够表征生物分子的非共价组件兴趣急剧3上升。
蛋白质分离技术是势在必行生物化学，生物物理学以及其他各种研究。目前本地分离技术具有intrinsiÇ缺陷减少下游分析，例如低分辨率，低吞吐量，损耗沉淀，和大量初始样品的要求兼容。串联亲和纯化通常用于蛋白质相互作用研究，但它必须为每个蛋白靶单独进行，导致它与高通量分析4不相容。尺寸排阻色谱法5，与所有已提供天然分离的，但本质上是低的分辨率的技术，并且需要高的初始样品量离子亲和层析5和密度梯度分离6选择性沉淀。
可替代地，基于凝胶的技术，如蓝母语（BN）和清除母语（CN）页（或1-D或2-D）显示的高分辨率分离。此外，与其他技术中提到的对比，这两种天然PAGE分离维持宽广的r溶解性和天然构象大分子物种，包括疏水性蛋白质的法兰。这种能力进一步扩大这些方法7,8达到了蛋白质组覆盖率，并通过CN和BN-PAGE之间不同的化学反应来实现的。 CN-PAGE通常依赖于软收取清洁剂为载体分子，取代了考马斯亮蓝染料BN-PAGE。 BN-PAGE，尽管具有较高的分辨率相关联，具有警告诸如在分离的蛋白8和考马斯分子加合物的形成降低的酶活性，后者大大有损于下游MS分析9。这两种方法，但是，在传统的低回收和窄蛋白质组覆盖率由于染色和凝胶提取局限性7相关联。
对于变性蛋白的研究，也有保持高分子的溶解度，同时执行具有高蛋白质回收率高分辨率分馏几种技术并且是与D兼容iverse分离后的蛋白质的分析技术。凝胶洗脱的液体馏分包封电泳（GELFrEE）是适合所有这些特征的分级分离技术之一。此方法是在高通量自上而下蛋白质组学研究大量应用，这表明它是快速和通用性。在GELFrEE，蛋白质变性并通过管状凝胶基质分隔基于分子量，它的孔隙率可以根据样品的要求和所需的分馏结果而变化。级分洗脱在液相，因而减少，同时保持高分辨率用SDS-PAGE相关联的恢复限制。分数等分试样然后可以通过1-D PAGE对于分子量带宽选择11进行分析。有用于与天然分离技术GELFrEE相关的优点的高需求。本文中所描述的方法中，清除本地GELFrEE（CN-GELFrEE），是GELFrEE土生土长适应。为了与一个宽s兼容在其天然状态大分子pectrum，这种方法不仅依赖于软CN-PAGE化学，而且还取决于孔隙率梯度分离，这通过消除存在于不连续的凝胶系统9孔隙率之间的苛刻过渡减少蛋白质沉淀。当施加到分馏从小鼠心脏提取的蛋白质复合物，洗脱的级分显示高回收率，得到一个宽范围的分子量的高分辨率分离。此外，将所得的级分与最下游的生物化学和生物物理蛋白质分析相容。
Protocol
Representative Results
Discussion
CN-GELFrEE是从使用作为基于分子量蛋白质分馏载体分子9阴离子和中性洗涤剂的混合物通过凝胶基质的清晰天然（CN）PAGE缓冲液系统的。 CN-GELFrEE的与天然小鼠心脏蛋白提取物中的应用产生的低复杂性的级分用分立的带宽，同时保持生物分子装配的非共价相互作用。 CN-PAGE和还原SDS-PAGE平板凝胶之间的级分的比较表明，展示在馏分大分子和蛋白链之间的二硫键断裂之间的非共价相互作用的损?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
该凯克基金会慷慨地为这项工作提供了资金。这种材料是基于由FAPERJ科研补助金100.039 / 2014里约热内卢州政府支持的工作 – 巴西RDM，从科学的协调高等教育人才的改进无国界奖学金88888.075416 / 2013-00，政府下巴西，高速钢，在团契号2014171659美国国家科学基金会研究生研究奖学金用于OSS，以及研究的CNPq拨款，巴西LHFDVPCH政府202011 / 2012-7是生命的西北大学的化学的接收方处理研究所博士后奖学金二等奖。
Materials
| Reagents | |||
| 30% acrylamide/bis solution, 37.5:1 | Bio-Rad | 161-0158 | This solution is neurotoxic. |
| 6-aminohexanoic acid (ε-aminocaproic acid) | Sigma-Aldrich | A2504 | This chemical is an irritant. |
| Ammonium persulfate (APS) | Fisher Scientific | 7727-54-0 | This chemical is flammable, toxic, and corrosive. |
| Coomassie blue G250 | Bio-Rad | 161-0406 | |
| Dodecylmaltoside | Sigma-Aldrich | D4641 | This chemical is an irritant. |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | FLUKA | 3777 | This chemical is toxic. |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP120 | This chemical is toxic. |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Liquid nitrogen | Any supplier | n/a | Store liquid nitrogen in containers designed for low-temperature liquids |
| Mouse heart | Bioreclamation LLC | MSE-HEART | |
| n-butanol | Fisher Scientific | 71-36-3 | This chemical is flammable and toxic. |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | BP103 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific | 78430 | This chemical is toxic. |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | This chemical is an irritant. |
| Sucrose | JTBaker | 4097 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 161-0800 | This chemical flammable and irritant. |
| Tris-HCl | Amresco | M151 | |
| Trycine | Bio-Rad | 161-071 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Gradient mixer | Hoefer | SG15 | |
| Magnetic stir | Any supplier | n/a | |
| Magnetic bars | Any supplier | n/a | Small enough to fit inside the gradiet mixer chambers. |
| Power supply | Bio-Rad | 164-5056 | Voltage up to 1,500 V |
| Refrigerated centrifugue | Eppendorf | 022622552 | Up to 15,000 x g |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 15 mL conical tube | Any supplier | n/a | |
| 30-kDa-MWCO ultra centrifugal filter | Millipore | UFC503096 | |
| Flexible tubing | Saint-Gobain | B000FOV1J0 | Approximately 1 m length |
| Ice bucket | Any supplier | n/a | |
| Liquid/air metallic or plastic valve. (e.g. aquarium air/water flow control lever valve) | Any supplier | n/a | Aquarium valves are compatible. |
| Mortar and pestle | Any supplier | n/a | |
| Native PAGE 3-12% T slab gel | Invitrogen | BN1003 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Protein low bind tube 1.5 mL | Eppendorf | 022431081 | |
| Razor blade | IDL Tools | TE05-091C | |
| Regenerated cellulose dialysis tubing 3,500 MWCO | Fisher Scientific | 21-152-9 | |
| SDS-PAGE slab gel for any kDa | Bio-Rad | 456-9036 | |
| Serological pipets (25 ml) | VWR | 89130-900 | |
| Syringe (10 ml) | Any supplier | n/a | |
References
- Alberts, B. The Cell as a Collection of Protein Machines: Preparing the Next Generation of Molecular Biologists. Cell. 92 (3), 291-294 (1998).
- Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. Analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (8), 645-654 (2007).
- Gavin, A. C., Bösche, M., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
- Puig, O., Caspary, F., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Cremer, K. D., Hulle, M. V., et al. Fractionation of vanadium complexes in serum, packed cells and tissues of Wistar rats by means of gel filtration and anion-exchange chromatography. JBIC J. Biol. Inorg. Chem. 7 (7-8), 884-890 (2002).
- Tanese, N. Small-Scale Density Gradient Sedimentation to Separate and Analyze Multiprotein Complexes. Methods. 12 (3), 224-234 (1997).
- Bunai, K., Yamane, K. Effectiveness and limitation of two-dimensional gel electrophoresis in bacterial membrane protein proteomics and perspectives. J. Chromatogr. B. 815 (1-2), 227-236 (2005).
- Wittig, I., Schägger, H. Advantages and limitations of clear-native PAGE. PROTEOMICS. 5 (17), 4338-4346 (2005).
- Skinner, O. S., Do Vale, L. H. F., et al. Native GELFrEE: A New Separation Technique for Biomolecular Assemblies. Anal. Chem. 87 (5), 3032-3038 (2015).
- Nijtmans, L. G. J., Henderson, N. S., Holt, I. J. Blue Native electrophoresis to study mitochondrial and other protein complexes. Methods. 26 (4), 327-334 (2002).
- Tran, J. C., Doucette, A. A. Gel-Eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis: An Electrophoretic Method for Broad Molecular Weight Range Proteome Separation. Anal. Chem. 80 (5), 1568-1573 (2008).
- Smith, P. K., Krohn, R. I., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
