La formación de imágenes estructuras subcelulares en el embrión vivo de pez cebra

En imágenes in vivo proporciona una visualización directa de los comportamientos celulares en el contexto más fisiológica. La transparencia de los embriones de pez cebra, su rápido desarrollo y externa y una rica variedad de herramientas genéticas que permiten el marcaje fluorescente, han contribuido a la creciente utilización de la microscopía in vivo para dilucidar la dinámica de eventos de desarrollo claves. Los estudios de imágenes del desarrollo del sistema nervioso en el pez cebra tienen, por ejemplo, se expandió enormemente nuestro conocimiento del comportamiento de las células progenitoras neurales y el destino de su progenie, incluyendo su posterior migración, la diferenciación y la integración del circuito ^1-8.

El escenario está listo para investigar la dinámica subcelulares que subyacen a estos comportamientos celulares. De hecho, el pez cebra ya están siendo explotados como herramientas para la biología de las células en vivo. Ahora es posible visualizar las mitocondrias ^9-11, centrosomas ^{2,8,12-14, 15} de Golgi, Los microtúbulos y la actina ^{4 16} citoesqueleto, endosomes ¹⁷ y los componentes de la membrana apical complejo ^1,18, entre otras estructuras subcelulares en embriones de pez cebra en vivo. Hasta ahora, gran parte de lo que se conoce acerca de la función de estos orgánulos proviene de estudiar su comportamiento en células cultivadas. Mientras que los estudios in vitro han dado mucha información sobre los biología celular, las células en cultivo no representan plenamente la complejidad de la situación in vivo y por lo tanto no reflejan necesariamente la función y dinámica de los orgánulos subcelulares in vivo. Embriones de pez cebra ofrecen una alternativa viable en vivo para examinar la dinámica subcelulares.

Como los vertebrados, el pez cebra posee muchos sistemas de órganos (por ejemplo, la retina neural) que son homólogas a las que se encuentran en especies de mamíferos. Además, embriones de pez cebra son cada vez más utilizados para modelar enfermedades humanas ^19,20 </sarriba>, incluidos los relacionados con la función centrosómicas (por ejemplo, microcefalia ²¹ y amaurosis ²² congénita de Leber) y para la función mitocondrial (por ejemplo, enfermedad de Parkinson ^23, tauopatías ^10,24 y el síndrome de Barth ^25). imágenes in vivo a nivel celular y subcelular en estos casos permitirá una mejor comprensión de la biología de las células que subyace a estos estados patológicos.

El objetivo general de los métodos descritos aquí es proporcionar una guía completa para investigar orgánulos y otras estructuras subcelulares en embriones de pez cebra utilizando microscopía de luz en vivo. Todo el flujo de trabajo involucrado en la visualización y el seguimiento de las estructuras subcelulares en vivo se describe – a partir de enfoques genéticos de etiquetado, para generar transitoriamente expresar y peces transgénicos estable, y finalmente a la formación de imágenes usando de campo amplio y microscopía confocal. Aunque cada uno de estos procedures es utilizada por numerosos laboratorios de pez cebra, los protocolos descritos se han optimizado y simplificado para la investigación de la dinámica de las estructuras subcelulares. Dos aspectos específicos del trabajo aquí descrito garantizan mención: En primer lugar, el uso del sistema de expresión Gal4-UAS en múltiples configuraciones para genéticamente orgánulos de la etiqueta en tipos celulares específicos. En segundo lugar, una comparación directa de campo amplio y microscopía confocal a las estructuras subcelulares de imagen in vivo.

Las estrategias actuales para modificar genéticamente los orgánulos de la etiqueta y otras estructuras subcelulares en el pez cebra o bien hacer uso de cubiertas de ARNm ^1,4,8 o construcciones de ADN basada en elementos promotores conducen directamente la expresión de proteínas de fusión ^9,14,15. Transcrito in vitro de ARN en cubiertas resultados rápida y amplia expresión, que no es específica de tejido sin embargo. Además, los niveles de expresión disminuyen con el tiempo que el ARN tapado se diluye o se degrada. Así, el uso de ARN basadoconstruye para examinar la dinámica de orgánulos en las etapas posteriores de desarrollo es limitado (generalmente hasta 3 días después de la fertilización).

Estas limitaciones se pueden superar mediante el uso de construcciones de ADN, donde el control espacial y temporal de la expresión se determina por elementos promotores específicos. Cuando construcciones basadas ADN se utilizan en el contexto del sistema de Gal4-UAS mejoras significativas en los niveles de expresión del transgen se observan ^26,27. En este sistema de expresión bipartito, de tipo celular elementos promotores específicos conducir la expresión de un activador transcripcional Gal4, mientras que los genes informadores son clonados aguas abajo de la secuencia de activación aguas arriba Gal4 vinculante (UAS). Mediante la combinación de UAS reporteros con conductores Gal4 apropiadas, la expresión puede limitarse a tipos de células específicos, eludiendo la necesidad de clonar genes informadores detrás de diferentes promotores cada vez que se desea un patrón de expresión específico. Además, la expresión de múltiples genes indicadores UAS puede serimpulsado por un solo activador Gal4. Así, el sistema Gal4-UAS ofrece un enfoque genético versátil y flexible para el etiquetado subcelular.

De gran campo y microscopios confocal son los caballos de batalla de la mayoría de los laboratorios. sistemas de campo amplia suelen utilizar una lámpara de arco como fuente de luz y detectar la luz emitida con una cámara sensible que se coloca al final de la trayectoria de la luz. Esta modalidad de imagen está normalmente restringido a muestras delgadas como fuera de foco luz oscurece la información de enfoque en las muestras más gruesas. Microscopios confocales difieren de los sistemas de campo amplio en el que se construyen para favorecer las señales que se originan en el plano focal sobre los que se originan fuera de foco (es decir, "seccionamiento óptico") ^28. Para lograr seccionamiento óptico de un agujero de alfiler se coloca en la trayectoria de emisión en una posición conjugada a la fuente de luz puntual. Los láseres son utilizados como fuentes de luz y las señales se detectan con tubos fotomultiplicadores (PMT). Prácticamente, un láserhaz se desliza sobre la muestra de punto por punto y la emisión de fluorescencia en cada punto (pixel) es detectada por el PMT.

Aquí la imagen de las mismas estructuras subcelulares en embriones de pez cebra de estar utilizando tanto de gran campo y la microscopía confocal para proporcionar una comparación directa de ambas modalidades de microscopía. El objetivo subyacente de proporcionar este tipo de comparaciones es ofrecer directrices para la elección de la técnica de microscopía más apropiada para la cuestión específica que nos ocupa.

El uso de los enfoques descritos aquí demostramos Gal4-UAS etiquetado con base genética de las mitocondrias y los centrosomas. Estos orgánulos son imágenes en diferentes tipos de células del sistema nervioso y en las células musculares usando de campo amplio y microscopía confocal para demostrar la idoneidad de cada modalidad de imagen. Los métodos descritos aquí se pueden adaptar fácilmente para la investigación de otros orgánulos y estructuras subcelulares en el embrión de pez cebra vivo.