Imaging strutture subcellulari nell'embrione Living Zebrafish

Imaging in vivo fornisce la visualizzazione diretta dei comportamenti cellulari nel contesto più fisiologico. La trasparenza di embrioni di zebrafish, il loro sviluppo rapido ed esterna e una ricca gamma di strumenti genetici che consentono l'etichettatura fluorescente hanno contribuito al crescente utilizzo della microscopia in vivo per chiarire la dinamica degli eventi chiave dello sviluppo. Studi di imaging di sviluppo del sistema nervoso in zebrafish hanno ad esempio notevolmente ampliato la nostra conoscenza del comportamento delle cellule progenitrici neurali e il destino della loro progenie compreso il loro successiva migrazione, differenziazione e integrazione del circuito ^1-8.

Il palcoscenico è ora impostata per indagare le dinamiche subcellulari alla base di tali comportamenti cellulari. Infatti, zebrafish sono già sfruttate come strumenti per in vivo biologia cellulare. Ora è possibile visualizzare i mitocondri ^9-11, centrosomi ^2,8,12-14, Golgi ¹⁵, Il citoscheletro microtubuli ⁴ e actina ^16, endosomi ¹⁷ e componenti della membrana apicale complesso ^1,18, tra le altre strutture subcellulari in embrioni di zebrafish in vivo. Finora, gran parte di ciò che si conosce la funzione di questi organelli viene da studiare il loro comportamento in cellule in coltura. Mentre gli studi in vitro hanno dato un enorme comprensione della biologia delle cellule, cellule in coltura non rappresentano appieno la complessità della situazione in vivo e quindi non riflettono necessariamente la funzione e le dinamiche di organelli subcellulari in vivo. Embrioni di zebrafish offrono una valida alternativa in vivo per esaminare le dinamiche subcellulari.

Come vertebrati, zebrafish possiede molti organi (ad esempio, retina neurale) che sono omologhi a quelli trovati in specie di mammiferi. Inoltre, gli embrioni di zebrafish sono sempre più utilizzati per modellare malattie umane ^19,20 </sup>, compresi quelli relativi alla funzione centrosomica (ad esempio, microcefalia ²¹ e amaurosi ²² congenita di Leber) e per la funzione mitocondriale (ad esempio, il morbo di Parkinson ^23, tauopatie ^10,24 e sindrome di Barth ^25). In vivo l'imaging a livello cellulare e subcellulare in questi casi consenta una migliore comprensione della biologia cellulare alla base di questi stati patologici.

L'obiettivo generale dei metodi descritti qui è quello di fornire una guida completa per indagare organelli e altre strutture subcellulari in embrioni di zebrafish utilizzando in microscopia ottica vivo. L'intero flusso di lavoro coinvolti nella visualizzazione e il monitoraggio delle strutture subcellulari in vivo è descritto – da approcci genetici di etichettatura, a generare transitoriamente esprimere e pesce transgenico stabile, e, infine, per l'imaging con grande campo e microscopia confocale. Mentre ciascuno di questi procedures è utilizzato da numerosi laboratori di zebrafish, i protocolli descritti sono ottimizzati e semplificato per indagare le dinamiche di strutture subcellulari. Due aspetti specifici del lavoro descritto qui meritano menzione: In primo luogo, l'uso del sistema di espressione GAL4-UAS in più configurazioni per geneticamente organelli etichette in specifici tipi di cellule. In secondo luogo, un confronto diretto di tutto il campo e microscopia confocale a strutture subcellulari di immagini in vivo.

Le attuali strategie geneticamente organelli etichette e altre strutture subcellulari in zebrafish o fare uso di capped mRNA ^1,4,8 o costrutti di DNA a base dove elementi promotori di auto direttamente l'espressione di proteine ​​di fusione ^9,14,15. Trascritto in vitro ricoperto risultati di RNA a rapida e ampia espressione, che non è tessuto-specifica però. Inoltre, i livelli di espressione diminuiscono nel tempo come RNA capped viene diluito o degradato. Pertanto, l'uso di RNA basatocostruisce per esaminare le dinamiche organelli in fasi successive di sviluppo è limitata (in genere fino a 3 giorni dopo la fecondazione).

Queste limitazioni possono essere superate usando costrutti di DNA, dove il controllo spaziale e temporale di espressione è determinato da elementi promotori specifici. Quando costrutti di DNA a base sono utilizzati nel contesto del sistema GAL4-UAS significativi miglioramenti a livello di espressione del transgene si osservano ^26,27. In questo sistema di espressione bilaterale, di tipo a cella specifici elementi promotori guidano l'espressione di un attivatore trascrizionale GAL4, mentre geni reporter vengono clonati a valle della sequenza attivante a monte GAL4-binding (UAS). Combinando UAS giornalisti con opportuni driver GAL4, espressione può essere limitata a specifici tipi di cellule, eludendo la necessità di clonare geni reporter dietro vari promotori ogni volta che un pattern di espressione specifici si desidera. Inoltre, l'espressione di geni multipli UAS giornalista può essereguidato da un unico attivatore GAL4. Il sistema GAL4-UAS fornisce quindi un approccio genetico versatile e flessibile per l'etichettatura subcellulare.

Wide-field e microscopi confocale sono i cavalli di lavoro della maggior parte dei laboratori. sistemi a grande campo tipicamente utilizzano una lampada ad arco come sorgente luminosa e rilevare la luce emessa con una camera sensibile che è posto al termine del percorso della luce. Questa modalità di imaging è in genere limitata a campioni sottili come fuori-di luce fuoco oscura informazioni di messa a fuoco in campioni più spessi. Microscopi confocali differiscono dai sistemi largo campo dal fatto che essi sono costruiti per favorire segnali provenienti dal piano focale rispetto a quelli che hanno origine fuori fuoco (cioè, "sezionamento ottico") ^28. Per ottenere sezionamento ottico un foro è inserito nel percorso di emissione in grado coniugato alla sorgente di luce puntiforme. I laser sono utilizzati come sorgenti di luce ed i segnali vengono rilevati con tubi fotomoltiplicatori (PMT). In pratica, un laserfascio viene strisciato sul campione punto per punto e l'emissione di fluorescenza ad ogni punto (pixel) viene rilevata dal PMT.

Qui immagine le stesse strutture subcellulari in embrioni di zebrafish vivere utilizzando sia a livello di campo e di microscopia confocale per fornire un confronto diretto di entrambe le modalità di microscopia. L'obiettivo di fondo di fornire tali confronti è quello di offrire le linee guida per la scelta della tecnica di microscopia più appropriata per la questione specifica a portata di mano.

Utilizzando gli approcci descritti qui dimostriamo GAL4-UAS basato etichettatura genetica dei mitocondri e dei centrosomi. Questi organelli vengono esposte in diversi tipi di cellule del sistema nervoso e in cellule muscolari con largo campo e microscopia confocale a dimostrare l'idoneità di ogni modalità di imaging. I metodi descritti qui possono essere facilmente adattate per indagare altri organelli e strutture subcellulari nell'embrione zebrafish vivente.