코어 텍스, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, 횡 중격 Nucleus-과 줄무늬 별<em> 자궁 내</em> C57BL / 6 마우스에서 Electroporation에
Summary
This protocol describes in detail how to specifically transfect different regions in the C57BL/6 central nervous system via in utero electroporation. Included in this protocol are detailed instructions for transfections of regions that develop into the cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, lateral septal nucleus and striatum.
Abstract
In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous system. Overexpression of desired genes is just as possible as shRNA mediated loss-of-function studies. Therefore it offers a wide range of applications. The feasibility to target particular cells in a distinct area further increases the range of potential applications of this very useful method. For efficiently targeting specific regions knowledge about the subtleties, such as the embryonic stage, the voltage to apply and most importantly the position of the electrodes, is indispensable.
Here, we provide a detailed protocol that allows for specific and efficient in utero electroporation of several regions of the C57BL/6 mouse central nervous system. In particular it is shown how to transfect regions the develop into the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus. For this information about the appropriate embryonic stage, the appropriate voltage for the corresponding embryonic stage is provided. Most importantly an angle-map, which indicates the appropriate position of the positive pole, is depicted. This standardized protocol helps to facilitate efficient in utero electroporation, which might also lead to a reduced number of animals.
Introduction
3 개의 독립적 인 그룹 1-3에 의해 2001 년 처음 소개 이후 N 자궁 일렉트로는 설치류 중추 신경계에서의 유전자 발현을 분석하기 위해 널리 사용되는 표준 도구가되었다. 지속적으로 개선 기술, 아직 시간과 돈 단순하기 때문에, 자궁 내 전기 호소 소비에도 불구하고,이다 녹아웃 마우스의 세대에 비해. 따라서, 자궁 내 전기는 신속하고 효율적인 이득이 손실-의 기능 연구 (4)를 할 수 있습니다.
뇌 영역 트랜, 음으로 하전 된 플라스미드를 함유하는 용액이 뇌실 내로 주입된다. 전기 펄스 동안, 음으로 하전 된 DNA는 양극으로 이동한다 따라서 형질 영역은 양극의 위치를 변경하여 간단하게 선택할 수있다. 그것은 자주 중추 신경계의 다양한 영역 (TA)이 될 수 있음을 보여왔다3,5-8를 rgeted. 예를 들어, 최근의 연구는 해마, 배 모양의 피질이나 줄무늬 9-11의 특정 형질을 보여줍니다. 그러나, 해당 위치에 대한 정보는 거의 종종 표준화되지 않고, 항상 상이한 마우스 균주로 전송할 쉽지 않다.
특정 배아 단계의 형질 사소한는 거리가 멀다. 자궁의 전기의 특정을위한 셋업을 선택할 때 많은 영향을 미치는 요인을 고려해야합니다. 먼저, 각각의 최적 배아 단계 형질, 적절한 전압에 대한 지식이 필요하다. 낮은 전압이 형질 전환 효율을 감소 2,3,12 반면 고전압은 생존율을 감소시킨다. 또한 전극 패의 크기가 중요한 역할을 감소 특이성에 너무 큰 결과 또는 인해 심장 리듬 4,12,13의 애정에 사망에이를 수 있습니다 전극 충격기를 사용하기 때문이다. 적용전압의 크기와 전극 패들의 위치가 고려하는 가장 중요한 특징이지만, DNA-용액의 도포량 같이 전기의 결과에 영향을 미치는 또 다른 요인들도있다.
우리는 C57BL / 6 마우스 12 다양한 뇌 영역의 빠르고 효율적인 형질 있도록 상세한 프로토콜을 개발했다. 이 프로토콜에서 전압에 대한 자세한 정보는 사용되는 향상된 특이성 전극 패들의 크기가 제공된다. 또한, 심실 대한 정보 플라스미드 용액의 양 전극의 위치에 대한 권장 사항이 공급과 함께 충전된다. 지도와 이러한 위치의 더 시각화의 자세한 위치 정보의 표시는 retrosplenial 피질, 운동 피질, 체성 감각 피질, 배 모양의 피질, T의 자궁의 전기에서 간단 구체적이고 효율적으로 할 수 있습니다그는 ammonis 1-3, 치아 이랑 (dentate gyrus), 선조체, 측 중격 핵, 시상과 시상 하부 cornu.
Protocol
Representative Results
Discussion
This protocol describes in detail how to transfect the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus of C75BL/6 mice. With all the provided information this is the first protocol, which supplies all necessary information to easily recreate transfections of these cerebral regions in the C57BL/6 mouse. Previous publications are mostly focused only on a few specific r…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Technical supported by Melanie Pfeifer and Nikolai Schmarowski (Institute for Microscopic Anatomy and Neurobiology, University Medical Center Mainz).
Materials
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| Fast Green | Roth | 0301.1 | |
| pCAGGS | Addgene | ||
| borosilicate glass capillaries (0.8-0.9 mm diameter) | Wold Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 | |
| Isoflurane (Forene) | Abbott | PZN 4831850 | |
| Carprofen (Rimadyl) | Pfizer GmbH | approval number: 400684.00.00 | |
| eye ointment (Bepanthen Augen und Nasensalbe) | Bayer | PZN 01578681 | |
| 0.9% benzyl alcohol 0.9% saline solution | Pharmacy of the University Medical Center Mainz |
||
| gauze (ES-Kompressen) | Hartmann | 407835 | |
| sterile 5-0 Perma-Hand Silk Suture | Ethicon Johnson & Johnson | K890H | |
| ring forceps 1/ 1.5 mm | Fine Science Tools | 11101-09 | |
| ring forceps 4.8/ 6 mm | Fine Science Tools | 11106-09 | |
| ring forceps 2.2/ 3 mm | Fine Science Tools | 11103-09 | |
| Adson Forceps-Serrated Straight 12 cm | Fine Science Tools | 1106-12 | |
| IrisScissors-Delicate Straight-Sharp/Blunt 10 cm | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Mayo-Stille Scissors-Straight 15 cm | Fine Science Tools | 14012-15 | |
| Dumont #5 Forceps-Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Castroviejo NeedleHolder-with Lock-Tungsten Carbide 14 cm | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| Elektroporator CUY21 SC | Nepa Gene Co. | ||
| FST 250 Hot Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Microgrinder EG-44 | Narishige | ||
| P-97 Micropette Puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| Platinum electrodes 650P 0.5 mm | Nepagene | CUY650P0.5 | |
| Platinum electrodes 650P 3 mm | Nepagene | CUY650P3 | |
| Platinum electrodes 650P 5 mm | Nepagene | CUY650P5 | |
| Platinum electrodes 650P 10 mm | Nepagene | CUY650P10 | |
| Anesthesia system | Rothacher-Medical GmbH | CV-30511-3 Vapor 19.3 | |
| Heating plate | Rothacher-Medical GmbH | HP-1M | |
| Temperature Controller 220V AC | Rothacher-Medical GmbH | TCAT-2LV |
References
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