Summary

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Laterale Septal Nucleus- en Striatum-specifieke<em> In Utero</em> Elektroporatie in de C57BL / 6 muis

Published: January 18, 2016
doi:

Summary

This protocol describes in detail how to specifically transfect different regions in the C57BL/6 central nervous system via in utero electroporation. Included in this protocol are detailed instructions for transfections of regions that develop into the cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, lateral septal nucleus and striatum.

Abstract

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous system. Overexpression of desired genes is just as possible as shRNA mediated loss-of-function studies. Therefore it offers a wide range of applications. The feasibility to target particular cells in a distinct area further increases the range of potential applications of this very useful method. For efficiently targeting specific regions knowledge about the subtleties, such as the embryonic stage, the voltage to apply and most importantly the position of the electrodes, is indispensable.

Here, we provide a detailed protocol that allows for specific and efficient in utero electroporation of several regions of the C57BL/6 mouse central nervous system. In particular it is shown how to transfect regions the develop into the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus. For this information about the appropriate embryonic stage, the appropriate voltage for the corresponding embryonic stage is provided. Most importantly an angle-map, which indicates the appropriate position of the positive pole, is depicted. This standardized protocol helps to facilitate efficient in utero electroporation, which might also lead to a reduced number of animals.

Introduction

Sinds de eerste beschrijving in 2001 door drie onafhankelijke groepen 1-3 i n utero elektroporatie is een veel gebruikte standaard voor de analyse van genexpressie bij knaagdieren centrale zenuwstelsel. Vergeleken met het genereren van knockout muizen, die ondanks continue verbetering van de technieken, nog tijd en geld kost, de in utero elektroporatie beroep vanwege zijn eenvoud. Dus, in de baarmoeder elektroporatie maakt snel en efficiënt gain en verlies-van-functie studies 4.

Om de cerebrale gebieden transfecteren, wordt de oplossing die de negatief geladen plasmide geïnjecteerd in een hartkamer. Tijdens de elektrische puls, de negatief geladen DNA migreert naar de positieve pool en derhalve de getransfecteerde gebied kan eenvoudig worden geselecteerd door het veranderen van de positie van de positieve pool. Het is herhaaldelijk aangetoond dat talrijke gebieden van het centrale zenuwstelsel kan worden targeted 3,5-8. Bijvoorbeeld, recente studies tonen specifieke transfecties van de hippocampus, de piriformis cortex of het striatum 9-11. De informatie over de geschikte posities zijn vaak slechts nauwelijks gestandaardiseerd en zijn niet altijd eenvoudig tussen verschillende muizenstammen.

Transfectie van bepaalde embryonale stadia verre van triviaal. Vele invloedsfactoren moet rekening worden gehouden bij de keuze van de set-up voor de specifieke in de baarmoeder elektroporatie. Eerst optimaal transfecteren de respectievelijke embryonale stadia, is kennis over de juiste voltages vereist. Hoge spanningen verminderen de overlevingskans, terwijl lage spanningen verminderen van de transfectie-efficiëntie 2,3,12. Ook de grootte van de elektrode peddel speelt een cruciale rol, omdat het gebruik van elektrode peddels te grote uitslagen in gereduceerde specificiteit of kan de dood veroorzaken door aantasting van het hartritme 4,12,13. De toegepastespanning en de grootte en de positie van de elektrode schoep zijn de belangrijkste kenmerken te overwegen, maar er zijn ook andere factoren die de uitkomst van de elektroporatie, zoals de toegepaste hoeveelheid DNA-oplossing.

We hebben een gedetailleerd protocol dat snelle en efficiënte transfectie van diverse cerebrale gebieden van de C57BL / 6 muis 12 maakt ontwikkeld. In dit protocol gedetailleerde informatie over de spanningen worden gebruikt en de afmeting van de elektrode peddel voor verbeterde specificiteit verschaft. Verdere informatie over het ventrikel te vullen met aanbevelingen voor de hoeveelheid plasmide-oplossing en de positie van de elektrode wordt geleverd. De aanduiding van de gedetailleerde positie-informatie in de kaart en de verdere visualisatie van deze posities mogelijk maakt eenvoudige specifiek en efficiënt in utero elektroporatie van de retrospleniale cortex, de motorische cortex, de somatosensorische cortex, de piriformis cortex t,Hij cornu ammonis 1-3, de dentate gyrus, de striatum, de laterale septum nucleus, de thalamus en hypothalamus.

Protocol

Ethiek Verklaring: De behandeling van de muizen en de experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de Europese, nationale en institutionele richtlijnen voor de verzorging van de dieren. 1. In Utero Elektroporatie Opmerking: In utero elektroporatie werd uitgevoerd zoals eerder gepubliceerd 12,14. Derhalve is de werkwijze slechts kort hieronder beschreven (figuur 1). Voorbereidingen <…

Representative Results

Figuur 2 toont voorbeelden van de specifieke in de baarmoeder elektroporatie van de regio te ontwikkelen in de retrospleniale cortex, de motorische cortex, de somatosensorische cortex, de piriformis cortex, de Cornu Ammonis 1-3, de dentate gyrus, het striatum, de laterale septum nucleus , de thalamus en hypothalamus. De resultaten van de transfecties wordt getoond naast de aanbevolen hoek (figuur 2). Voor een betere visualisatie van de hoeken in vivo de positi…

Discussion

This protocol describes in detail how to transfect the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus of C75BL/6 mice. With all the provided information this is the first protocol, which supplies all necessary information to easily recreate transfections of these cerebral regions in the C57BL/6 mouse. Previous publications are mostly focused only on a few specific r…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Technical supported by Melanie Pfeifer and Nikolai Schmarowski (Institute for Microscopic Anatomy and Neurobiology, University Medical Center Mainz).

Materials

EndoFree Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12362
Fast Green Roth 0301.1
pCAGGS Addgene
borosilicate glass capillaries (0.8-0.9 mm diameter) Wold Precision Instrument Inc. 1B100F-4
Isoflurane (Forene) Abbott PZN 4831850
Carprofen (Rimadyl) Pfizer GmbH approval number: 400684.00.00
eye ointment (Bepanthen Augen und Nasensalbe) Bayer  PZN 01578681
0.9% benzyl alcohol 0.9% saline solution Pharmacy
of the University Medical Center Mainz
gauze (ES-Kompressen) Hartmann 407835
sterile 5-0 Perma-Hand Silk Suture Ethicon Johnson & Johnson K890H
ring forceps 1/ 1.5 mm Fine Science Tools 11101-09
ring forceps 4.8/ 6 mm Fine Science Tools 11106-09
ring forceps 2.2/ 3 mm Fine Science Tools 11103-09
Adson Forceps-Serrated Straight 12 cm Fine Science Tools 1106-12
IrisScissors-Delicate Straight-Sharp/Blunt 10 cm Fine Science Tools 14028-10
Mayo-Stille Scissors-Straight 15 cm Fine Science Tools 14012-15
Dumont #5 Forceps-Inox Fine Science Tools 11251-20
Castroviejo NeedleHolder-with Lock-Tungsten Carbide 14 cm Fine Science Tools 12565-14
Elektroporator CUY21 SC  Nepa Gene Co.
FST 250 Hot Bead Sterilizer Fine Science Tools 18000-45
Microgrinder EG-44 Narishige
P-97 Micropette Puller Sutter Instrument Company P-97
Platinum electrodes 650P 0.5 mm Nepagene CUY650P0.5
Platinum electrodes 650P 3 mm Nepagene CUY650P3
Platinum electrodes 650P 5 mm Nepagene CUY650P5
Platinum electrodes 650P 10 mm Nepagene CUY650P10
Anesthesia system Rothacher-Medical GmbH CV-30511-3 Vapor 19.3
Heating plate Rothacher-Medical GmbH HP-1M
Temperature Controller 220V AC Rothacher-Medical GmbH TCAT-2LV

References

  1. Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294 (5544), 1071-1074 (2001).
  2. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
  3. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. 神经科学. 103 (4), 865-872 (2001).
  4. LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19 (July), i120-i125 (1991).
  5. Nakahira, E., Yuasa, S. Neuronal generation, migration, and differentiation in the mouse hippocampal primoridium as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation. J Comp Neurol. 483 (3), 329-340 (2005).
  6. Navarro-Quiroga, I., Chittajallu, R., Gallo, V., Haydar, T. F. Long-term, selective gene expression in developing and adult hippocampal pyramidal neurons using focal in utero electroporation. J Neurosci. 27 (19), 5007-5011 (2007).
  7. Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. J Neurosci Methods. 143 (2), 151-158 (2005).
  8. Kolk, S. M., de Mooij-Malsen, A. J., Martens, G. J. M. Spatiotemporal Molecular Approach of in utero Electroporation to Functionally Decipher Endophenotypes in Neurodevelopmental Disorders. FNMOL. 4 (November), 37 (2011).
  9. Tomita, K., Kubo, K. I., Ishii, K., Nakajima, K. Disrupted-in-schizophrenia-1 (Disc1) is necessary for migration of the pyramidal neurons during mouse hippocampal development. Hu Mol Gen. 20 (14), 2834-2845 (2011).
  10. Niwa, M., Kamiya, A., et al. Knockdown of DISC1 by In Utero Gene Transfer Disturbs Postnatal Dopaminergic Maturation in the Frontal Cortex and Leads to Adult Behavioral Deficits. Neuron. 65 (4), 480-489 (2010).
  11. Nakahira, E., Kagawa, T., Shimizu, T., Goulding, M. D., Ikenaka, K. Direct evidence that ventral forebrain cells migrate to the cortex and contribute to the generation of cortical myelinating oligodendrocytes. Dev Biol. 291 (1), 123-131 (2006).
  12. Baumgart, J., Grebe, N. C57BL/6-specific conditions for efficient in utero electroporation of the central nervous system. J Neurosci Methods. 240, 116-124 (2015).
  13. Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat Protc. 1 (3), 1552-1558 (2006).
  14. Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. JoVE. (54), (2011).
  15. Guedel, A. E. . Inhalation anesthesia: a fundamental guide. , (1937).
  16. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. JoVE. (65), e3564 (2012).
  17. Mizutani, K., Saito, T. Progenitors resume generating neurons after temporary inhibition of neurogenesis by Notch activation in the mammalian cerebral cortex. Development. 132 (6), 1295-1304 (2005).
  18. Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Dev, Growth & Differ. 50 (6), 507-511 (2008).

Play Video

Cite This Article
Baumgart, J., Baumgart, N. Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse. J. Vis. Exp. (107), e53303, doi:10.3791/53303 (2016).

View Video