This protocol describes in detail how to specifically transfect different regions in the C57BL/6 central nervous system via in utero electroporation. Included in this protocol are detailed instructions for transfections of regions that develop into the cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, lateral septal nucleus and striatum.
In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous system. Overexpression of desired genes is just as possible as shRNA mediated loss-of-function studies. Therefore it offers a wide range of applications. The feasibility to target particular cells in a distinct area further increases the range of potential applications of this very useful method. For efficiently targeting specific regions knowledge about the subtleties, such as the embryonic stage, the voltage to apply and most importantly the position of the electrodes, is indispensable.
Here, we provide a detailed protocol that allows for specific and efficient in utero electroporation of several regions of the C57BL/6 mouse central nervous system. In particular it is shown how to transfect regions the develop into the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus. For this information about the appropriate embryonic stage, the appropriate voltage for the corresponding embryonic stage is provided. Most importantly an angle-map, which indicates the appropriate position of the positive pole, is depicted. This standardized protocol helps to facilitate efficient in utero electroporation, which might also lead to a reduced number of animals.
तीन स्वतंत्र समूहों 1-3 से 2001 में पहली वर्णन के बाद से मैं n utero electroporation कृंतक केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में जीन की अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल मानक उपकरण बन गया है। लगातार सुधार तकनीक, अभी भी समय और पैसे की वजह से अपनी सादगी के लिए, गर्भाशय में इलेक्ट्रोपोरेशन अपील की खपत के बावजूद है, जो पीटा चूहों की पीढ़ी की तुलना में। तो, गर्भाशय में electroporation के तेज और कुशल gain- और नुकसान के समारोह के अध्ययन के 4 सक्षम बनाता है।
मस्तिष्क क्षेत्रों transfect करने के लिए, नकारात्मक आरोप लगाया प्लाज्मिड युक्त समाधान के लिए एक वेंट्रिकल में इंजेक्ट किया जाता है। बिजली नाड़ी के दौरान, नकारात्मक आरोप लगाया डीएनए सकारात्मक ध्रुव की ओर migrates और इसलिए ट्रांसफ़ेक्ट क्षेत्र सकारात्मक पोल की स्थिति बदलकर बस का चयन किया जा सकता है। यह बार बार केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के कई क्षेत्रों टा हो सकता है कि दिखाया गया है3,5-8 rgeted। उदाहरण के लिए, हाल ही के अध्ययन हिप्पोकैम्पस, piriform प्रांतस्था या स्ट्रिएटम 9-11 के विशिष्ट transfections दिखा। हालांकि, उचित पदों के बारे में जानकारी अक्सर ही शायद ही मानकीकृत कर रहे हैं और हमेशा अलग माउस उपभेदों के लिए स्थानांतरण करने के लिए आसान नहीं हैं।
कुछ भ्रूण चरणों के अभिकर्मक तुच्छ से दूर है। Utero electroporation में विशिष्ट के लिए सेट-अप का चयन करते समय बहुत से प्रभावित करने वाले कारकों को ध्यान में रखा जाना चाहिए। सबसे पहले, बेहतर संबंधित भ्रूण चरणों transfect करने के लिए, उचित voltages के बारे में ज्ञान की जरूरत है। कम वोल्टेज अभिकर्मक दक्षता 2,3,12 को कम जबकि उच्च वोल्टेज, जीवित रहने की दर में कमी। इसके अलावा इलेक्ट्रोड चप्पू के आकार, एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता कम हो विशिष्टता में बहुत बड़ी परिणाम हैं या कारण दिल ताल 4,12,13 के स्नेह के लिए मौत का कारण बन सकता है कि इलेक्ट्रोड paddles का उपयोग करते हैं। लागू कियावोल्टेज और आकार और इलेक्ट्रोड चप्पू की स्थिति पर विचार करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण विशेषताएं हैं, लेकिन डीएनए समाधान के एप्लाइड राशि की तरह, इलेक्ट्रोपोरेशन के परिणाम को प्रभावित करने के लिए आगे कारकों को भी देखते हैं।
हम C57BL 6 / माउस 12 के विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों के तेज और कुशल अभिकर्मक सक्षम बनाता है जो एक विस्तृत प्रोटोकॉल विकसित किया है। इस प्रोटोकॉल में voltages के बारे में विस्तृत जानकारी का उपयोग किया जा करने के लिए और बढ़ाया विशिष्टता के लिए इलेक्ट्रोड चप्पू के आकार प्रदान की जाती है। इसके अलावा, निलय के बारे में जानकारी प्लाज्मिड समाधान की राशि और इलेक्ट्रोड के पद के लिए सिफारिशें की आपूर्ति की है के साथ भरा जाना है। एक नक्शा और इन पदों के आगे दृश्य में विस्तृत स्थिति की जानकारी के संकेत retrosplenial कॉर्टेक्स, मोटर कॉर्टेक्स, somatosensory प्रांतस्था, piriform प्रांतस्था, टी के utero electroporation में सीधा विशिष्ट और कुशल सक्षम बनाता हैवह एम्मोनिस 1-3, दांतेदार गाइरस, स्ट्रिएटम, पार्श्व सेप्टल नाभिक, चेतक और हाइपोथेलेमस Cornu।
This protocol describes in detail how to transfect the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus of C75BL/6 mice. With all the provided information this is the first protocol, which supplies all necessary information to easily recreate transfections of these cerebral regions in the C57BL/6 mouse. Previous publications are mostly focused only on a few specific r…
The authors have nothing to disclose.
Technical supported by Melanie Pfeifer and Nikolai Schmarowski (Institute for Microscopic Anatomy and Neurobiology, University Medical Center Mainz).
EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
Fast Green | Roth | 0301.1 | |
pCAGGS | Addgene | ||
borosilicate glass capillaries (0.8-0.9 mm diameter) | Wold Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 | |
Isoflurane (Forene) | Abbott | PZN 4831850 | |
Carprofen (Rimadyl) | Pfizer GmbH | approval number: 400684.00.00 | |
eye ointment (Bepanthen Augen und Nasensalbe) | Bayer | PZN 01578681 | |
0.9% benzyl alcohol 0.9% saline solution | Pharmacy of the University Medical Center Mainz |
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gauze (ES-Kompressen) | Hartmann | 407835 | |
sterile 5-0 Perma-Hand Silk Suture | Ethicon Johnson & Johnson | K890H | |
ring forceps 1/ 1.5 mm | Fine Science Tools | 11101-09 | |
ring forceps 4.8/ 6 mm | Fine Science Tools | 11106-09 | |
ring forceps 2.2/ 3 mm | Fine Science Tools | 11103-09 | |
Adson Forceps-Serrated Straight 12 cm | Fine Science Tools | 1106-12 | |
IrisScissors-Delicate Straight-Sharp/Blunt 10 cm | Fine Science Tools | 14028-10 | |
Mayo-Stille Scissors-Straight 15 cm | Fine Science Tools | 14012-15 | |
Dumont #5 Forceps-Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | |
Castroviejo NeedleHolder-with Lock-Tungsten Carbide 14 cm | Fine Science Tools | 12565-14 | |
Elektroporator CUY21 SC | Nepa Gene Co. | ||
FST 250 Hot Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
Microgrinder EG-44 | Narishige | ||
P-97 Micropette Puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
Platinum electrodes 650P 0.5 mm | Nepagene | CUY650P0.5 | |
Platinum electrodes 650P 3 mm | Nepagene | CUY650P3 | |
Platinum electrodes 650P 5 mm | Nepagene | CUY650P5 | |
Platinum electrodes 650P 10 mm | Nepagene | CUY650P10 | |
Anesthesia system | Rothacher-Medical GmbH | CV-30511-3 Vapor 19.3 | |
Heating plate | Rothacher-Medical GmbH | HP-1M | |
Temperature Controller 220V AC | Rothacher-Medical GmbH | TCAT-2LV |