SH-SY5Y 인간 신경 모세포종 세포 라인의 차별화
Summary
It is critical in neurobiology and neurovirology to have a reliable, replicable in vitro system that serves as a translational model for what occurs in vivo in human neurons. This protocol describes how to culture and differentiate SH-SY5Y human neuroblastoma cells into viable neurons for use in in vitro applications.
Abstract
Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and the neurosciences. Traditional in vitro experimental models used in neurobiology include primary neuronal cultures from rats and mice, neuroblastoma cell lines including rat B35 and mouse Neuro-2A cells, rat PC12 cells, and short-term slice cultures. While many researchers rely on these models, they lack a human component and observed experimental effects could be exclusive to the respective species and may not occur identically in humans. Additionally, although these cells are neurons, they may have unstable karyotypes, making their use problematic for studies of gene expression and reproducible studies of cell signaling. It is therefore important to develop more consistent models of human neurological disease.
The following procedure describes an easy-to-follow, reproducible method to obtain homogenous and viable human neuronal cultures, by differentiating the chromosomally stable human neuroblastoma cell line, SH-SY5Y. This method integrates several previously described methods1-4 and is based on sequential removal of serum from media. The timeline includes gradual serum-starvation, with introduction of extracellular matrix proteins and neurotrophic factors. This allows neurons to differentiate, while epithelial cells are selected against, resulting in a homogeneous neuronal culture. Representative results demonstrate the successful differentiation of SH-SY5Y neuroblastoma cells from an initial epithelial-like cell phenotype into a more expansive and branched neuronal phenotype. This protocol offers a reliable way to generate homogeneous populations of neuronal cultures that can be used for subsequent biochemical and molecular analyses, which provides researchers with a more accurate translational model of human infection and disease.
Introduction
시험 관내 모델 시스템에 사용하는 능력은 크게 신경 생물학 및 신경 과학 분야를 강화하고있다. 배양 세포가 감염 질병의 병리를 이해하고, 예비 약물 시험 평가를 수행하는 단백질의 기능 및 분자 기전 특정 현상을 특징 효율적인 플랫폼을 제공한다. 신경 생물학에서 세포 배양 모델의 주요 유형은 쥐 B35 세포 5 신경 2A 마우스 세포 6, 랫트 PC12 세포는 7 쥐 및 신경 아세포종 세포주 유래의 주요 신경 배양 물을 포함한다. 이러한 세포주의 사용이 크게 필드 진행 하였지만, 비 – 인간 세포 및 조직 처리와 연관된 여러 교란 요인이있다. 인간과 비교했을 때 이러한 이해 종 특이 대사 과정의 차이, 질병 증상 및 발병 기전의 표현형을 포함한다. 이 점에 유의하는 것이 중요하다설치류 모델 제약 경로는 설치류와 인간 사이에서 보존되는 8-11 이해 중요성 강조 마우스 및 인간의 유전자 발현 및 전사 인자 신호 사이에 상당한 차이가 다시한다. 기타 N-테라 -2- (NT2) 인간 기형 암종 세포주 유도 성 및 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)를 포함한 인간 신경 세포 라인의 사용을 채용 하였다. 이 세포주는 체외 인간의 시스템에 대한 좋은 모델을 제공합니다. 그러나, 레티노 산 (RA) 신경 교세포의 혼합 집단의 생성을 초래하고 추가의 정제 공정을 필요 반경 신경교 세포 (12)와 NT2 세포의 분화 신경 세포 집단을 순수 얻었다. 또한 NT2 세포는 세포의 72 %보다 큰 60 염색체와 매우 가변적 핵형 13 보여준다. iPSCs는 다른 세포 라인 사이의 차별화에 다양성을 보여 분화 효율에 차이가 14. 이들 대안을 편안하게 일관되고 재현 인간 신경 세포 모델을 갖는 것이 바람직하다.
SH-SY5Y의 neuroblast 같은 세포는 부모의 신경 모세포종 세포주 SK-N-SH의 서브 클론입니다. 부모 세포주 neuroblast 같은 상피 세포 형 (15)을 모두 포함하는 골수 생검 1970에서 발생 하였다. SH-SY5Y 세포를 47 염색체 이루어진 안정한 핵형을 가지고, 다른 RA의 사용을 포함하는 메커니즘, 포르 볼 에스테르 및 뇌 유래 특정 뉴로 통해 다양한 성숙한 인간 뉴런에 neuroblast 같은 상태로부터 구별 될 수있다 신경 영양 인자 (BDNF). 선행 증거는 다른 방법의 사용은 아드레날린, 콜린성 및 도파민 뉴런 16,17 특정 신경 세포 아형에 대해 선택할 수있는 제안한다. 이 후자의 측면은 신경 생물학 실험의 다수 유용 SH-SY5Y 세포를 만든다.
ontent는 "> 여러 연구는 미분화와 차별화 된 지역에서의 SH-SY5Y 세포 사이의 중요한 차이점을 지적했다. 때 SH-SY5Y 세포는 미분화, 그들은 빠르게 증식과 거의 짧은 프로세스와, 비 편광 것으로 보인다. 그들은 종종 성장 분화시 미성숙 뉴런 18,19 나타내는 덩어리 및 발현 마커. 이러한 세포는 긴 분지 프로세스 증식의 저하를 확장하고, 어떤 경우에는 2,18을 편광. 완전히 분화 된 SH-SY5Y 세포는 이전에 표현하는 것으로 입증되었다 성장 관련 단백질 (GAP-43), 신경 핵 (NeuN), synaptophysin에 (SYN), 시냅스 소포 단백질 II (SV2), 신경 세포 특이에 놀라 (NSE)와 미세 소관 연관 단백질 (MAP)를 포함하여 성숙한 신경 세포의 다른 마커의 다양한 2,16,17,20, 이러한 glial fibrillary 산성 단백질 (GFAP) 4 등의 폐해 마커의 발현을 부족합니다. SH-SY5Y 세포가 represe 차별화 추가 지원에NT 균질 신경 인구 BDNF를 제거하여 세포 사멸 4 초래한다. 이는 차별화 된 SH-SY5Y 세포의 생존 신경 세포를 성숙 비슷한 영양 요인에 따라 달라집니다 것이 좋습니다.서브 클론 1978 3 년에 설립 된 이후 SH-SY5Y 세포의 사용은 증가하고있다. 그 사용의 예는 파킨슨 병 (17), 알츠하이머 병 (21), 및 폴리오 바이러스 (22), 엔테로 바이러스 71 (EV71)를 포함하는 바이러스 감염의 병인 (23, 24)을 조사 포함 수두 – 대상 포진 바이러스 (VZV) 1, 인간 거대 세포 바이러스 (25), 및 단순 포진 바이러스 (HSV) 2,26. 특히 neurovirology 27-36 분야, SH-SY5Y 세포는 미분화 형태로 이들 세포를 사용하여 한 것을 여러 연구가 중요하다. 분화 된 SH-SY5Y 세포에 비해 미분화 관찰 된 표현형의 차이 whe에 의문을 제기THER 감염의 진행을 관찰 성숙한 분화 된 신경 세포에서 상이한 것이다. 예를 들어, 분화 된 SH-SY5Y 세포에 의한 HSV 결합 미분화 SH-SY5Y 세포를 2 엔트리를 변조 표면 수용체의 부족 일 수있다 분화, 증식 SH-SY5Y 세포, 대 HSV-1 흡수 높은 효율을 갖는다. 이는 시험관 내에서 신경 세포를 테스트에 초점을 맞춘 실험을 설계 할 때, SH-SY5Y 세포를 생체 내 모델로 변환하고 비교에 대한 가장 정확한 결과를 얻기 위하여 구별되어야 함 때문에 중요하다.
인간 신경 세포 배양 물을 생성하는 신뢰할 수있는 방법의 개발이 연구 정확하게 인간 신경계 병진 모델 실험을 수행 할 수 있도록하는 것이 필수적이다. 여기에 제시된 프로토콜은 차별화되는 인간의 신경 세포에 대한 풍부 이전의 방법 1-4에서 파생 된 모범 사례를 묘사 절차레티노 산을 사용.
Protocol
Representative Results
Discussion
위의 프로토콜은 균일하고 가능한 인간의 신경 세포 문화를 생성하는 간단하고 재현성있는 방법을 제공한다. 이 프로토콜은 기술과 각각의 모범 사례를 서술하는 데 몇 이전에 발행 된 방법 1-4과 목표를 통합하는 방법을 사용합니다. SH-SY5Y 세포의 분화는 점진적으로 혈청 부족에 의존; 레티노 산, 향 신경성 인자 및 세포 외 기질 단백질의 첨가; 시리얼 분할 차별화 성숙한 부착 뉴런 선택…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful for the contributions of Yolanda Tafuri in optimizing conditions for SH-SY5Y differentiation, and for the support of Dr. Lynn Enquist, in whose lab this work was initiated. Y. Tafuri contributed the images shown in Figure 3. This work was supported by the NIH-NIAID Virus Pathogens Resource (ViPR) Bioinformatics Resource Center (MLS and L. Enquist) and K22 AI095384 (MLS).
Materials
| B-27 | Invitrogen | 17504-044 | See Table 1 for preparation |
| Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) | Sigma | SRP3014 (10ug)/B3795 (5ug) | See Table 1 for preparation |
| dibutyryl cyclic AMP (db-cAMP) | Sigma | D0627 | See Table 1 for preparation |
| DMSO | ATCC | 4-X | – |
| Minimum Essential Medium Eagle (EMEM) | Sigma | M5650 | – |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | See Table 1 for preparation |
| GlutamaxI | Life Technologies | 35050-061 | – |
| Glutamine | Hyclone | SH30034.01 | – |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366-1 | See Table 1 for preparation |
| MaxGel Extracellular Matrix (ECM) solution | Sigma | E0282 | See step 11 of the protocol |
| Neurobasal | Life Technologies | 21103-049 | – |
| Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Life Technologies | 15140-122 | – |
| Retinoic acid (RA) | Sigma | R2625 | Should be stored in the dark at 4° C because this reagent is light sensitive |
| SH-SY5Y Cells | ATCC | CRL-2266 | – |
| 0.5% Trypsin + EDTA | Life Technologies | 15400-054 | – |
| Falcon 35mm TC dishes | Falcon (A Corning Brand) | 353001 | – |
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