Summary

Saç türetilmiş keratinositlerden Kullanarak Entegrasyon serbest İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Published: August 20, 2015
doi:

Summary

This manuscript provides a step-by-step procedure for the derivation and maintenance of human keratinocytes from plucked hair and subsequent generation of integration-free human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) by episomal vectors.

Abstract

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using patient-specific hiPSCs allows the study of the underlying mechanism for pathogenesis, also providing a platform for the development of in vitro drug screening and gene therapy to improve treatment options. The promising potential of hiPSCs for regenerative medicine is also evident from the increasing number of publications (>7000) on iPSCs in recent years. Various cell types from distinct lineages have been successfully used for hiPSC generation, including skin fibroblasts, hematopoietic cells and epidermal keratinocytes. While skin biopsies and blood collection are routinely performed in many labs as a source of somatic cells for the generation of hiPSCs, the collection and subsequent derivation of hair keratinocytes are less commonly used. Hair-derived keratinocytes represent a non-invasive approach to obtain cell samples from patients. Here we outline a simple non-invasive method for the derivation of keratinocytes from plucked hair. We also provide instructions for maintenance of keratinocytes and subsequent reprogramming to generate integration-free hiPSC using episomal vectors.

Introduction

İnsan uyarılmış pluripotent kök hücreleri (hiPSCs) keşif hastaya özgü kök hücrelerin 1-3 üretimi için uygun bir yöntem sağlayan, rejeneratif tıp alanında devrim yarattı. hiPSCs başarılı fibroblastlar 4,5, hematopoietik hücrelerin 6,7, idrar 8 böbrek epitel hücreleri ve 9,10 keratinositler dahil olmak üzere çeşitli somatik hücre tiplerinin, elde edilmiştir. Bugüne kadar, deri fibroblastları ve hematopoietik hücreler hastaya özgü iPSCs üretilmesi için en yaygın olarak kullanılan hücre kaynağıdır. Muhtemelen, bu deri biyopsileri ve kan toplama rutin tıbbi prosedürler ve birçok ülkede kurulmuştur hastanın kan veya cilt örneklerinin büyük biyobankalar olmasından kaynaklanmaktadır.

Kan hücreleri ve invazif çıkarma yöntemleri gerektiren deri fibroblast aksine, keratinositler hiPSC üretimi için kolay erişilebilir bir hücre tipini temsil etmektedir. Keratinocytes cildin dış epidermal bariyer oluşturur ve ayrıca çivi ve saç 11'de bulunan keratin bakımından zengin epitel hücreleri vardır. Özellikle, keratinositler saç köklerinin, iç kök kılıfı (IRS) hücreleri (12, Şekil 1) ile birlikte saç gövdesine kaplı bir dış hücresel tabakanın dış kök kılıfı (ORS) bulunabilir. Saç toplama sağlık personelinin yardım gerektirmeyen, basit bir prosedür olduğu gibi hastaların toplamak ve büyük ölçüde hiPSC nesil için hasta örneklerinin koleksiyonu kolaylaştıracak laboratuvarlar, kendi saç örneklerini göndermek için, bir fırsat sağlar. Epidermal keratinositler, aynı zamanda hiPSC üretimi 9,13 başlangıç ​​hücreleri gibi keratinositleri kullanmanın avantajları ekleyerek, fibroblastlar ile karşılaştırıldığında daha yüksek bir yeniden programlama verimliliği ve daha hızlı bir yeniden programlama kinetiği sahiptir. Ayrıca, hiPSCs da saç folikülü içinde diğer hücre popülasyonları kullanılarak üretilebilir,saç folikülü 14,15 tabanında bulunan dermal papilla hücrelerini dahildir.

Saç türetilmiş hücreleri kullanarak iPSC nesil Önceki raporlar genellikle retroviral veya lentiviral tabanlı yeniden programlama yöntemlerini 9,14,15 kullanmaktadır. Ancak, bu viral yöntemler yeniden programlama sırasında yabancı transgenlerin istenmeyen genomik entegrasyon tanıtmak. Karşılaştırma olarak, epizomal vektörlerin kullanımı entegrasyonu içermeyen iPSCs 4 oluşturmak için uygun bir non-viral yeniden programlama yöntemi temsil eder. Biz daha önce verimli epizomal vektörler 13 kullanan hiPSCs içine keratinosit yeniden programlamak için basit, düşük maliyetli ve viral olmayan bir yöntem geliştirdik. Burada koparıp saç büyüme ve keratinositler bakım ve hiPSCs oluşturmak için daha sonra yeniden programlama ile ilgili keratinosit türetilmesi dahil olmak üzere, keratinosit türetilmiş hiPSCs, üretimi için ayrıntılı bir protokol sağlar.

Protocol

bireylerin insan saçı örnek toplama konak kurumlarında insan araştırma etik komitesi tarafından etik onayı gerektirir ve kurumsal kurallarına uygun yapılmalıdır. Mızraplı Saç gelen Keratinositler 1. İzolasyonu Buz O / N (yani, Matrigel) çözülme Ekstrasellüler Matriks (ECM) çözümü. Önceden soğutulmuş pipet uçları kullanılarak, soğutulmuş DMEM / F12 ortamında 12 ml 200 ul ECM çözeltisi ilave edilir. Kat her bir seyreltilmiş ECM …

Representative Results

anagen (büyüme fazı), katagen (regresyon fazı) ve telojen (dinlenme fazı) 20-21: saç 3 farklı büyüme döngüsünün evreleri geçer. anagen kıl folikülü epitel Birden çok katman içeren; Bu tabakalar ORS, IRS ve saç gövdesine (Şekil 1) içerir. Anagen kıl sonunda ORS ve saç şaft farklılaşma fesih apoptoz ile işaretlenir katajen faza, geçiş uğrar. Son olarak, apoptoz durur ve telojen folikül karakteristik telojen ile sakin olur telojen faza için katajen saç geçiş …

Discussion

Hastaya özgü hiPSCs üretilmesi, in vitro olarak hastalıklı hücre tiplerinde patojenezinin araştırılması için eşsiz bir yaklaşım sunmaktadır ve ayrıca hastalığın fenotipleri kurtarabilir yeni moleküllerin belirlenmesi için ilaç tarama için bir platform sağlar. HiPSCs kullanılarak bu hastalığa modelleme yaklaşımı uzun QT sendromu, Huntington hastalığı, Parkinson hastalığı ve amiyotrofik lateral skleroz 22 de dahil olmak üzere çeşitli hastalıkların, umut vaat ede…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors wish to thank Harene Ranjithakumaran and Stacey Jackson for technical support. This work was supported in part by grants from the National Health and Medical Research Council (R.C.B. Wong, A. Pébay), the University of Melbourne (R.C.B. Wong), Retina Australia (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung, A. Pébay) and the Ophthalmic Research Institute of Australia (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung, A. Pébay); Australian Research Council Future Fellowship (A. Pébay, FT140100047), Cranbourne Foundation Fellowship (R.C.B. Wong); intramural funding from the National Institutes for Health (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung) and operational infrastructure support from the Victorian Government.

Materials

Antibiotic Mix: 
250 ng/ml Antimycotic amphotericin B Sigma A2942-20ml Antibiotic mix is made up in PBS. 
1X Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122
PBS (-) Invitrogen 14190-144
Knockout Serum Replacement (KSR) medium:  KSR medium is filtered using Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) before use. bFGF is added fresh to the media before use.
20% knockout serum replacement (KSR) Invitrogen 10828-028
DMEM/F12 with glutamax Invitrogen 10565-042
1× MEM non-essential amino acid Invitrogen 11140-050
 0.5× Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122
 0.1 mM β-mercaptoethanol Invitrogen 21985
 bFGF (10 ng/ml, added fresh) Millipore GF003
Keratinocyte medium: 
 EpiLife with 60 µM Calcium Invitrogen M-EPI-500-CA
1× Human keratinocyte growth supplement (HKGS) Invitrogen S-001-5
Fetal Bovine Serum (FBS) medium:  FBS medium is filtered using Stericup (Millipore, #SCGPU05RE)  before use.
10% fetal bovine serum (FBS) Invitrogen 26140079
DMEM  Invitrogen 11995-073
0.5× Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122
2 mM L-glutamine Invitrogen 25030
0.25% trypsin-EDTA Invitrogen 25200-056
Extracellular Matrix (ECM):
Matrigel Corning  354234 Aliquot Matrigel stock and store in -80°C following manufacturer’s instructions. Stock concentration of Matrigel varies slightly from batch to batch (~9mg/ml). We recommend to use 200µl matrigel for coating a 12-well plate (~150µg/well). 
Coating Matrix Kit  Invitrogen R-011-K
Plasmids:  Note that pCXLE-eGFP is only used for monitoring transfection efficiency and is not required for reprogramming.
-          pCXLE-eGFP Addgene 27082
-          pCXLE-hOct3/4-shP53F Addgene 27077
-          pCXLE-hSK Addgene 27078
-          pCXLE-hUL Addgene 27080
Transfection reagent Fugene HD Promega E231B
Gelatin (from porcine skin) Sigma G1890 Make up 0.1% gelatin in distilled water. Autoclave before use. 
Reduced Serum medium: OPTI-MEM Invitrogen 31985062
Accutase Sigma A6964-100ml
Mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder MEF can be inactivated by mitomycin C treatment or irradiation as described previously 16.
26G needle Terumo NN2613R
6-well plate (tissue culture treated) BD Biosciences 353046
12-well plate (tissue culture treated) BD Biosciences 353043
10 cm dish (tissue culture treated) BD Biosciences 353003
Dispase Invitrogen 17105-041 Use at 10mg/ml
Collagenase IV Invitrogen 17104-019 Use at 1mg/ml
TRA-160 antibody Millipore MAB4360 Use at 5µg/ml
OCT4 antibody Santa Cruz SC-5279 Use at 5µg/ml
NANOG antibody R&D Systems AF1997 Use at 10µg/ml
MycoAlert Detection kit Lonza LT07-418

References

  1. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  3. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
  4. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat Methods. 8, 409-412 (2011).
  5. Park, I. H., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, U141-U141 (2008).
  6. Okita, K., et al. An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells. Stem Cells. 31, 458-466 (2013).
  7. Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nat Protoc. 7, 2013-2021 (2012).
  8. Zhou, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from urine. J Am Soc Nephrol. 22, 1221-1228 (2011).
  9. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol. 26, 1276-1284 (2008).
  10. Peters, A., Zambidis, E., Ye, K., Jin, S. Chapter 16. Generation of nonviral integration-free induced pluripotent stem cells from plucked human hair follicles. Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells: Lineage-Specific Differentiation Protocols.Springer Protocols Handbooks. , 203-227 (2012).
  11. Fuchs, E. Scratching the surface of skin development. Nature. 445, 834-842 (2007).
  12. Limat, A., Noser, F. K. Serial cultivation of single keratinocytes from the outer root sheath of human scalp hair follicles. J Invest Dermatol. 87, 485-488 (1986).
  13. Piao, Y., Hung, S. S., Lim, S. Y., Wong, R. C., Ko, M. S. Efficient generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from keratinocytes by simple transfection of episomal vectors. Stem Cells Transl Med. 3, 787-791 (2014).
  14. Higgins, C. A., et al. Reprogramming of human hair follicle dermal papilla cells into induced pluripotent stem cells. J Invest Dermatol. 132, 1725-1727 (2012).
  15. Muchkaeva, I. A., et al. Generation of iPS Cells from Human Hair Follice Dermal Papilla Cells. Acta naturae. 6, 45-53 (2014).
  16. Naaldijk, Y., Friedrich-Stockigt, A., Sethe, S., Stolzing, A. Comparison of different cooling rates for fibroblast and keratinocyte cryopreservation. J Tissue Eng Regen. , (2013).
  17. Sporl, F., et al. Real-time monitoring of membrane cholesterol reveals new insights into epidermal differentiation. J Invest Dermatol. 130, 1268-1278 (2010).
  18. Conner, D. A., et al., Ausubel, F. N., et al. Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation. Current protocols in molecular biology. 23, Unit 23 22 (2001).
  19. Pebay, A., et al. Essential roles of sphingosine-1-phosphate and platelet-derived growth factor in the maintenance of human embryonic stem cells. Stem Cells. 23, 1541-1548 (2005).
  20. Myung, P., Ito, M. Dissecting the bulge in hair regeneration. J Clin Invest. 122, 448-454 (2012).
  21. Alonso, L., Fuchs, E. The hair cycle. J Cell Sci. 119, 391-393 (2006).
  22. Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481, 295-305 (2012).
  23. Soares, F. A., Sheldon, M., Rao, M., Mummery, C., Vallier, L. International coordination of large-scale human induced pluripotent stem cell initiatives: Wellcome Trust and ISSCR workshops white paper. Stem cell reports. 3, 931-939 (2014).
  24. McKernan, R., Watt, F. M. What is the point of large-scale collections of human induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 31, 875-877 (2013).
  25. Utikal, J., et al. Immortalization eliminates a roadblock during cellular reprogramming into iPS cells. Nature. 460, U1145-U1112 (2009).
  26. Xu, Y., et al. Proliferation rate of somatic cells affects reprogramming efficiency. J Biol Chem. 288, 9767-9778 (2013).
  27. Liu, J., et al. Late passage human fibroblasts induced to pluripotency are capable of directed neuronal differentiation. Cell Transplant. 20, 193-203 (2011).
  28. Huallachain, M., Karczewski, K. J., Weissman, S. M., Urban, A. E., Snyder, M. P. Extensive genetic variation in somatic human tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 18018-18023 (2012).
  29. Abyzov, A., et al. Somatic copy number mosaicism in human skin revealed by induced pluripotent stem cells. Nature. 492, 438-442 (2012).

Play Video

Cite This Article
Hung, S. S., Pébay, A., Wong, R. C. Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes. J. Vis. Exp. (102), e53174, doi:10.3791/53174 (2015).

View Video